Summary
Lens geliştirme, diğer dokuları ile etkileşimleri içerir. Çeşitli zebrafish göz mutantlar anormal küçük bir lens boyutuna göre karakterize edilir. İşte biz bu fenotip içsel nedenler veya objektif çevreleyen dokuların arızalı etkileşimler nedeniyle olup olmadığını belirlemek için bir lens nakli deney göstermektedir.
Abstract
Objektifi, optik fincan [1,2] gelişiminde önemli bir rol oynar. Bir model organizma olarak zebrafish kullanılması, objektif gelişimi ile ilgili sorular ele alınabilir. Zebrafish dahil olmak üzere birçok avantajlı özellikleri, küçük boyutu, yüksek fekondite, kısa bir yaşam döngüsü, ve bakım kolaylığı nedeniyle genetik çalışmalar için yararlıdır. Lens geliştirme zebrafish hızla oluşur. 72 hpf, zebrafish objektif fonksiyonel olgun [3]. Bol ve moleküler genetik kaynakları zebrafish araştırmaları desteklemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, diğer omurgalıların zebrafish göz benzerlik, insan kusurları mükemmel bir hayvan modeli [4-7] olarak kullanımı için temel sağlar . Birkaç zebrafish mutantlar, bazı durumlarda objektif dokularda tam bir dejenerasyon hücre ölümüne yol açan yüksek seviyede, [8]. Da dahil olmak üzere, lens anormallikler de sergileyebilirler
Lens anormallikleri içsel nedenler ya da çevre dokulara arızalı etkileşimleri nedeniyle olup olmadığını belirlemek için, bir mutant yabani tip bir göz içine lens nakli yapılır. Dikkatli bir şekilde kullanılması yangına cilalanmış metal iğneler, mutant ya da yabani tip lensler donör hayvan disseke ve sahibi aktarılır. Yabani tip ve mutant dokuların ayırt etmek için, bir transgenik çizgi donör olarak kullanılır. Bu satır, lens dahil olmak üzere tüm dokularda membran-bağlı GFP ifade eder. Bu nakli tekniği zebrafish lens mutantlar çalışmalarda önemli bir araçtır.
Protocol
Bölüm 1: embriyoların hazırlanması
Bu protokol, varsayımsal bir zebrafish objektif mutant göstermek için jj xy sembolü kullanabilirsiniz.
- Zebra balığı suşları 14h light/10h karanlık döngüsü 28.5 C'de standart balık tesisi şartlarda muhafaza edilir.
- Akşam, erkek ve zebrafish gerginlik jj xy kadınların yer: AB / TU, birbirinden ayırmak için bölücü ile bir tank tg (mGFP). Bu haç döl tüm dokularda GFP transgen ifade edecek ve bağışçılar olarak kullanılacaktır. Buna paralel olarak, transgenik olmayan yabani tip hayvanlar arasındaki haçlar kurmak için aynı prosedürü kullanın. Bu deneyin amacı bağlı olarak, bir bağışçılar veya ana gibi jj xy lokustaki yabani tip hayvanlar geçebilir.
- Sabah ışık yanar sonra bir saat içinde balık, çiftleşmek için izin vermek için bölücüler çıkarın.
- 15-30 dakika 100 x 15 mm Petri kapları embriyolar topladıktan sonra, onlara temiz ve orta (yumurta su) değiştirmek.
- 28.5 C inkübatörde embriyolar istenilen zaman kadar tutun.
- Transplantasyon için hazır, iki çift keskin forseps ile koryon el kaldırmak ve embriyoların% 0.2 EDTA kalsiyum ZFR 30 dakika inkübe edin.
Bölüm 2: diseksiyon iğneleri Hazırlık
- Ve donör objektif hareket ve ev sahibi içine girmek için kullanılan bir künt bir iğne, lens çevre dokulara kesmek koryon kaldırmak ve agaroz serbest embriyolar kullanılır bilenmiş biri: nakli prosedürü iki tür iğneler gerektirir. İşte biz bu iğneler nasıl yapılacağını göstereceğim.
- Birincisi, bir elmas bıçak kullanarak Pasteur pipet ucu kesilmiş olmalıdır. Sonra bir cam kapiller uzunluğu yaklaşık yarısı içinde böylece Pasteur pipet içine yerleştirin. Bu kolay bir sonraki adım cam içine eriterek tungsten tel hareketsiz hale getirecektir.
- Sonra ince kılcal açık ucunu bir tungsten tel yerleştirin. Bunsen beki ile tel üzerinden cam eritin. Elinizle iğnenin diğer ucunu büküm forseps kullanarak, metal tel ile sabit cam sonunda tutun. Yumuşatılmış cam, metal çevresinde sarmal yerde sürükleyici olmalıdır.
- Künt bir ucu iğne yapıyorsanız, o zaman bu prosedürün sonuna. Bilenmiş bir iğne oluşturmak için, çok ince uçlu oluşturulur böylece metal yakarak, Bunsen beki üzerinden 1-1.5 dakika tungsten tel tutun. Microscropy.It ucu kalite nakli hemen önce birkaç saniye için alev hem de iğneler sterilize etmek için iyi bir fikir olup olmadığını kontrol edin.
Bölüm 3: reaktiflerin hazırlanması
- Kalsiyum-Zebra balığı Ringer (ZFR) Çözümleri (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 5 mM HEPES, pH 7.2)
- Kalsiyum Zebra balığı Ringer Çözümleri (pH 7,2)% 0.2 EDTA
- Kalsiyum ücretsiz ZFR% 1.2 agaroz (düşük erime noktası)
- Kalsiyum ücretsiz ZFR% 0.2 agaroz (düşük erime noktası)
- Embriyo orta (pH 7.0, litre başına içerir: 10 ml Hanks Çözüm # 1, 1 ml Hanks Çözüm # 2, 10ml Hanks Çözüm # 4, 10ml Hanks Çözüm # 5, 0.35 g sodyum bikarbonat, 300 uL 2M HCl, penisilin-streptomisin 500.000 U) Zebra balığı Kitap (Oregon Üniversitesi Press, 2000) gibi.
- Tungsten tel, altın kaplama, 0.1mm çap, Alfa Aesar
- Kapiler tüp, 1.0mm çap, Dünya Hassas Aletler
Bölüm 4: Transplantasyon prosedürü
- Plastik bir santrifüj tüpüne, bir su banyosunda 40 ° C önceden ısıtılmış kalsiyum ücretsiz ZFR% 1.2 düşük erime noktası agaroz hazırlamak.
- Istenilen evre (30 hpf, örneğin), bir Pasteur pipeti embriyoların sürebilir santrifüj tüpü içine yavaş yavaş onları kovmak ve santrifüj tüpü içine yavaş yavaş onları kovmak ve yaklaşık 5 saniye boyunca inkübe edin. Donörler ve bilgisayarlara ayrı inkübe edilmelidir.
- Bir pipet ile,% 1.2 agaroz santrifüj tüpüne embriyoların kadar sürebilir ve 100mm polistiren Petri kabındaki iki paralel sıralar halinde düzenlemek, host ve donörlerin ayrı tutulması. Yavaş ve dikkatli bir şekilde onları pipetleme, en embriyolar agaroz onların yüzüne yalan. Agaroz katılaşır önce göz yukarı bakacak şekilde künt bir iğne kullanılarak bu pozisyonda yalan olmadığını reorient gerekecektir.
- Sağlamlaştırmak için% 1.2 agaroz için bekleyin ve daha sonra% 0.2 düşük erime noktası agaroz çözümü ile kaplaması.
- Bilenmiş bir iğne yardımıyla, göz çevresi herhangi bir agaroz kaldırmak ve çok dikkatli bir şekilde küçük bir vuruş kullanan ev sahibi ve donör embriyoları mercek kesip. Lensin yeterince yakın şekilde gözyaşı kesmek için emin olun, ancak bu nedenle ev sahibi göz geri kalanından çok fazla doku çıkarmayın.
- Bir kez ücretsiz, lensler orta float. Künt iğne kullanarak, dikkatli bir şekilde donör itinobjektif sadece normal ev sahibi objektif olacağını yerini yukarıda ve daha sonra göz içine künt iğne ile aşağı doğru itin. Ev sahibi objektif atılabilir.
- 30-60 dakika süreyle% 1.2 agaroz donör ve host embriyolar bırakın, sonra keskin bir iğne kullanılarak agaroz onları serbest bırakın ve embriyo orta ile 24 plaka içine aktarabilirsiniz. Her embriyo ayrı bir iyi kurulmalıdır. Bu yüzden düzgün bir şekilde ev sahibi olan donör tekabül eden net olduğunu kuyuların etiket emin olun.
- 28.5 C inkübe donör elde edilen objektif, aynı hayvanın GFP floresan dayalı unoperated tarafta ev sahibi objektif ayırt edilebilir. Bölümleri de objektif boyutunu ölçmek için ve düzgün bir şekilde ayıran olup olmadığını belirlemek için yapılabilir.
Şekil 1 objektif nakli için kullanılan bir bilenmiş iğne Düşük büyütme görüntü. Kılcal bir cam Pasteur pipeti (A) (B) eklenir ve kılcal açık ucuna ince bir tungsten teli (C) eklenir. Tel üzerinden cam bir Bunsen beki ile yumuşatılmış. Pasteur pipetin diğer ucunu elinizle büküm forseps kullanarak, metal tel ile sabit cam sonunda tutun. Yumuşatılmış cam bir yere sürükleyici, metal etrafında sarmal.
Şekil 2 objektif nakli için kullanılan iki çeşit iğne uçları.
Şekil 3 Embriyolar 30hpf objektif nakli yapıldı. Gösterilen bir donör embriyo (A, B), nakledilen lens (C, D) ile bir host göz ve ev sahibi embriyo kontrol tarafı (E, F). Belirtildiği gibi her bir göz iletilen ışık ve UV aydınlatma hem de gösterilmiştir. Fotoğraflar 48 hpf alınmıştır. Q01 [9] transgenik hattı bu deneyde kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birkaç adım objektif transplantasyon sırasında özel dikkat gerektirir.
- Bilenmiş iğneler: objektif nakli yapılmadan önce birkaç iğne hazırlamak için daha iyi ve iğne ucu mümkün olduğunca ince olmalıdır. Kalın iğne gözü iyileşmek için bir başarısızlık neden daha geniş çapı nedeniyle daha fazla doku gözyaşı.
- Embriyoların Düzenleme: onlar, yan yatarken, böylece sağ nakli önce size embriyoların pozisyon gerekir. Yerleştirirken,% 1.2 agaroz sertleşerek çok hızlı. Agaroz, sertleştirme yavaş, Petri kabı 40 ° C su banyosunda float izin vererek önceden ısıtılmış olabilir.
- Donör konak göz içine mercek takmadan önce, mümkün olduğu kadar ev sahibi başının etrafında kadar çok agaroz kaldırmak için çalışın. Bu donör lens bu şekilde eklemek için kolay.
- Sadece objektif transplantasyonu sonrası embriyoların% 0.2 agaroz tabakası ile kaplı% 1.2 agaroz katmanı gömülü bırakılmalıdır. Antibiyotikler ile embriyo orta ekleme donör ve host embriyolar hem de yara iyileşmesini teşvik edecektir. Agaroz embriyolarında bırakmadan önce 30-60 dakika bekleyin ve sonra embriyonun orta ile 24 plaka içine aktarabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu prosedür, Bill Jeffrey laboratuar tarafından mağara balıkları için geliştirilmiş nakli tekniği büyük ölçüde izler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1mm diameter tungsten wire | A Johnson Matthey | 45086 | |
| Agarose(low melting point) | Sigma-Aldrich | 39346 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-4 | |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette pump | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Petri Dish | Cardinal Health | D1906 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 |
References
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
- Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).
- Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).
- Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).
- Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
- Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).
