Измерение завод клеточной стенки Extension (Creep), индуцированный кислой и Альфа-Expansin

Summary

Мы демонстрируем использование экстензометр постоянной силы для измерения долгосрочного расширения (ползучести) растения образцов клеточной стенки индуцированных кислой буферов и expansin белка.

Abstract

Рост стен растительной клетки характерно выставки свойство, известное как «кислота роста", под которой мы понимаем что они более расширяемой при низких значениях рН (<5) ^1. Ауксина растительный гормон быстро стимулирует клеточное удлинение в молодые стебли и аналогичных тканей по крайней мере частично кислотно-механизм роста ^{2, 3.} Ауксин активизирует Н ⁺ насоса в плазматической мембраны, вызывая закисление решение клеточной стенки. Стена подкисления активизирует expansins, которые являются эндогенными клеточной стенки, ослабление ⁴ белков, что приводит к клеточной стенке поддаваться на стене напряженность создана ячейка давления тургор. В результате клетка начинает быстро увеличить. Это явление "кислотных" рост легко измеряется в изолированных (неживой) образцов клеточной стенки. Способность клеточных стенок пройти вызванное кислотой расширение не просто результат структурных расположение полисахаридов клеточной стенки (например, пектины), но зависит от активности expansins ^5. Expansins нет никаких известных ферментативной активности и единственный способ анализа для expansin деятельности является измерение их индукции клеточного расширения стены. Это видео докладе подробно источники и методы подготовки получении подходящих стеновых материалов для expansin анализов и идет, чтобы показать, вызванное кислотой расширение и expansin вызванных расширением стене образцах, полученных из растущих гипокотиля огурец.

Чтобы получить подходящие образцы клеточной стенки, рассады огурцов выращивают в темноте, гипокотиля разрезаются и замораживали при -80 ° C. Замороженные гипокотиля являются прошлифовать, сплющенные, а затем зажат при постоянной напряженности в специальные кюветы для экстензометр измерений. Для измерения кислотно-индуцированной расширение, стены, первоначально буфер при нейтральном рН, что приводит к низкой активности expansins, которые являются компонентами родные стены клетки. По буфера обмена к кислым рН, expansins активируются и клеточных стенок распространяется быстро. Мы также продемонстрировать expansin активности в восстановлении анализа. Для этой части, мы используем краткой термической обработки для денатурации родной expansins в камере образцов стены. Эти инактивированной клеточной стенки не выходят даже в кислых буфер, но добавление expansins на клеточные стенки быстро восстанавливает их способность к расширению.

Protocol

Часть 1: Выращивание и хранение пригодного материала завода

1. По нашему опыту, молодые гипокотиля из этиолированных проростков огурца служить удобным источником клеточного материала стены для этих экспериментов. Огурец семена высевают на мокрой бумаге в светонепроницаемый ящик, который держать в темном шкафу в постоянной комнатной температуры установлен на уровне 26 ° C. Точная температура не является критической, как что-нибудь между 22 ° и 30 ° С должна быть тонкой, но температура будет определять, как быстро сеянцы достигают соответствующей стадии развития. Теплее температура, тем быстрее рассада будет развиваться. Мы обычно используют сеянцы, когда они выросли примерно до 5 см в длину, которое достигается через 3-4 дня после посева. Важно, чтобы саженец быть выращены в темноте, так как даже небольшое количество света влияют как на скорость развития всходов и свойства клеточной стенки, что мы измеряем с этой техникой. На 3-й день вы можете заглянуть в окно, используя тусклый зеленый рассеянный свет, чтобы проверить развития всходов.
2. Сеянцы быстро вырезать и упакованы в небольшие пластиковые коробки, 100-150 саженцев в коробке, и хранится при температуре -80 ° C. При этой температуре они остаются полезными на несколько недель.

Часть 2: Подготовка образцов клеточной стенки

1. Небольшие группы (8-10) замороженных саженцев сократить передаются из морозильной камеры изолированный контейнер, содержащий блок -80 морозильнике.
2. Кутикулы покрытие гипокотиля является стираются с карборунд. Это делается путем многократного рисования гипокотиля между большим и указательным пальцами, которые покрыты густой суспензии влажных карборунд порошок. Это займет немного опыта, чтобы знать правильное количество давления в использовании: слишком много давления и эпидермальный слой начинает измельченные и рваные; слишком мало давление и кутикулы, не будут проницаемыми. Надо также работать быстро, потому что, как замороженные гипокотиля тает, он становится вялым и трудно управлять.
3. Прошлифовать гипокотиля опускают в ледяную воду, чтобы удалить большую часть придерживаясь карборунд, а затем хранили на льду вода, а остальные гипокотиля готовятся в подобной манере.
4. Гипокотиля обрезаются до нужной длины, обычно 1,2 см, с новым синглом лезвием бритвы, а затем выравниваются по стеклу.
5. Теперь нам нужно, чтобы сгладить стен для удаления клеточного сока и для облегчения зажима. Второе предметное стекло помещается в верхней части группы из 8-10 образцов, образуя бутерброд. Веса (400-500 г) помещается в верхней части стекло в течение 5 мин. Для вес, мы обычно используем стакан, содержащий необходимое количество воды.
6. Дополнительный шаг: в зависимости от эксперимента, гипокотиля может быть инактивированной с краткой термической обработки в этой точке. Для этого мы связываем стеклах вместе с парой резинок, поместить сборку в контейнер с 100 мл деионизированной воды комнатной температуры и поместите его в микроволновую печь на полную мощность. С нашей микроволновой печи вода закипает при температуре около 50 с, и мы останавливаемся микроволновая 15 с после кипячения начинается. Горячая вода быстро сливается и заменяется с холодной водой, чтобы остановить денатурации. Возможно, вам придется изменять эти сроки, так как Ваша микроволновая печь может быть иным, чем у нас. С чрезмерное нагревание образцов становятся слабыми и легко ломаются. При недостаточном нагреве эндогенных expansin не инактивируется и стены сохраняют некоторые образцы реагирования на кислых рН.

Часть 3: экстензометр установки

1. Стены образцы в настоящее время зажаты в постоянном экстензометр силу. Это заказ устройство, которое состоит из оргстекла кюветы для проведения базального конца образца стены и подвижный зажим придается апикального конца образца. Подвижный зажим крепится на конце стержня, который проходит через открытые катушки датчика положения, LVDT или «Линейные дифференциальные трансформатор переменного», том, что электронные определяет положение небольшой металлический цилиндр, или «основных», то есть прикреплены к стержню. Верхний конец стержня связан с рычагом с регулируемым противовесом. Этот рычаг оказывает регулируемым количеством вверх силу образец стены. Силы регулируется путем добавления или удаления калиброванный вес металла в дальнем конце рычага.
2. Вернуться к образцу стене - базального конца гипокотиля образец взял с мелкими щипцов и ~ 2-3 мм апикального конца помещается между открытыми челюстями подвижного зажима. Этот зажим пружинным зажимом крокодил которых металл челюсти покрыты пластиковыми, чтобы избежать прямого контакта между поверхностью металла и буферного раствора или образец стены. В нашем опыте ионы металла могут проникать с зажимом и подавляют способность стены продлить, и поэтому мы продолжаем металла, покрытого.
3. Холдинг подвижный зажим сборки в одной руке, базального конца образца стены теперь маневрировал между двумя кусками шарнирных оргстекла кюветы и кюветычасти собраны вместе и ввернул туго, тем самым блокировку нижнем торце образца стене в кювете.
4. Подвижная сборка зажим теперь нежно освобождены, позволяющая в полную силу противовесы должны быть переданы образцы стену. Мы регулярно использовать Общий вес противовеса 20 г для образцов, приготовленных из стен огурец гипокотиля. Другие материалы стены или эксперименты могут потребовать разного веса.
5. Кювета заполняется буфер (200 мкл) и положение кювета перемещается вверх или вниз с шестигранной головкой, так что подвижный зажим привлечены к нижней части диапазона измерений LVDT. Наши LVDT подключен к единице сбора данных из микрокомпьютера, и поэтому мы отслеживаем LVDT позиции через компьютер. У нас есть восемь LVDT сборки параллельно с одним компьютером, что позволяет нам запускать 8 образцов стены одновременно. Компьютер записывает положение каждого из LVDT сборки через каждые 30 сек

Часть 4: Измерение ответ расширение до рН кислоты или expansin - представитель Результаты

1. [Первый эксперимент] Для измерения кислотно-индуцированной расширение, мы начинаем с родной образцы стене (то есть, не инактивированной теплом) и нейтральных буфера добавляется в кювету. Стены образцы продлить на несколько минут, в ответ на добавленную напряженности, но расширение распадается на низкой скорости в течение нескольких минут. Наш компьютер позволяет собирать либо изменение длины образца (то есть изменение положения подвижной зажим, после начала эксперимента), либо мы можем отслеживать производная по времени позиция, другими словами, скорость расширения . Расширение ставка стабилизируется к низкой стоимости со временем.
2. После ~ 20 мин, нейтральный буфер удаляется. Мы используем тонкие металла трубы, сделанные из больших иглу подкожных калибр, связанные с вакуумным насосом для удаления буфера быстро, с минимальным нарушением стене или механической сборки. Кислотные буфер затем добавил, иногда с 1-2 быстрого обмена для обеспечения полного обмена к кислотным буфером. Потом мы сидим сложа руки и наблюдать реакцию стене. Как правило, мы можем обнаружить более быстрыми темпами расширения в течение нескольких минут. Через 60 минут мы обычно имеем достаточно информации, чтобы оценивать расширение ответа, хотя в некоторых случаях измерения могут распространяться на более длительный период.
3. [Второй эксперимент] Для измерения expansin вызванных расширением клеточной стенки, мы начнем с тепло-инактивированной стене образцы и кислых буфера добавляется в кювету. Как и в первом эксперименте темп клеточных расширение стены постепенно стабилизируется к низкой стоимости из-за отсутствия функциональной expansin.
4. После ~ 20 мин, expansin белок добавляется к кювету под "пики" с буфером в кювету с 10-20 мкл решение expansin. Expansin быстро проникает пример клеточной стенки и в течение нескольких минут мы видим, что расширение ставка возросла. Это расширение ответ может последовать в течение часа или больше.

Рисунок 1: План процедур подготовки клеточных стенок для оценки вызванное кислотой или expansin вызванных стене расширение.

Discussion

Для демонстрации использовались клеточные стенки из огурца гипокотиля, потому что они оказались надежным источником образцов стены, которые легки в обращении и которые реагируют с хорошей чувствительностью. Мы также имели хороший успех со стенами из других саженцев, а также некоторые материалы из супермаркета, например, молодые листья шпината и стебли сельдерея. В основном, молодые, мягкие, быстро растущие растительные ткани, вероятно, будут легко измерить с этой техникой, но жесткие, старые, окисленные или nongrowing тканях растения вряд ли будет реагировать, потому клеточной стенки сшивки. Есть несколько других вещей, чтобы остерегаться:

1. Биологическая изменчивость - даже единый саженцы дают переменной ответов, так что минимум 5-8 повторяет необходимо для получения статистически значимых результатов.
2. Истирание кутикулы важно разрешить быстрое проникновение буферов и белков в образце клеточной стенки. Если кутикула не является достаточно прошлифовать, ответы на кислых буферов будет медленным и приглушенным и белки, не может даже проникнуть кутикулы, чтобы вызвать реакцию. Некоторые образцы не потребуется истиранию, то есть, если вы используете эпидермальный пилинг или другие расчлененные тканей. Неоднородные истиранию добавляет значительную изменчивость для многих новичков.
3. Тепло инактивации, которая используется для удаления или денатурировать эндогенных expansins, может осуществляться иными методами, но нужно найти минимальное количество отопления для инактивации эндогенных expansin, чтобы избежать чрезмерного ослабления и разрушения стен образцов.
4. Expansins склонны к инактивации путем окисления, поэтому 1-5 мм дитиотреитол в буфер обычно помогает стабилизировать деятельность.
5. Экстензометр не вне готовых часть оборудования, но требует специального строительства () кювета, который содержит образец стены и (б) LVDT-зажим-противовеса сборки. Интерфейс компьютер и устройство сбора данных не являются необходимыми, но представляют особую ценность для запуска одинаковых образцов одновременно и для анализа расширения кривые количественно.