Cella di misura Estensione impianto a parete (Creep), indotta dal pH acido e da Alpha-espansina

Summary

Dimostriamo l'uso di un estensimetro a forza costante per misurare la estensione a lungo termine (creep) di campioni di cellule vegetali muro indotta da buffer acidi e proteine ​​espansina.

Abstract

Crescente pareti delle cellule vegetali tipicamente mostrano una proprietà conosciuta come 'la crescita acido', con la quale si intende che sono più estensibili a pH basso (<5) ^1. L'ormone vegetale auxina stimola l'allungamento delle cellule in rapida steli giovani e tessuti simili, almeno in parte da un acido-crescita meccanismo ^{2, 3.} Auxina attiva una pompa H ⁺ nella membrana plasmatica, che causano l'acidificazione della soluzione di parete cellulare. Acidificazione muro attiva espansine, che sono endogeni-allentamento della parete cellulare delle proteine ^​​4, causando la parete cellulare di cedere alle tensioni muro creato dalla pressione di turgore delle cellule. Come risultato, la cellula comincia a ingrandire rapidamente. Questo fenomeno di 'crescita acido' è facilmente misurata in campioni di cellule isolate (non vivente) muro. La capacità delle pareti delle cellule di sottoporsi acido-indotta estensione non è semplicemente il risultato della sistemazione strutturale di polisaccaridi della parete della cella (pectine ad esempio), ma dipende dall'attività di espansine ^5. Espansine non hanno conosciuto alcuna attività enzimatica e l'unico modo di saggiare per l'attività espansina è quello di misurare la loro induzione di estensione della parete cellulare. Questa relazione Dettagli video le fonti e tecniche di preparazione per l'ottenimento di Pareti di materiali idonei per saggi espansina e continua a mostrare acido-indotta estensione e espansina indotta estensione dei campioni parete preparata da hypocotyls cetriolo in crescita.

Per ottenere campioni idonei parete cellulare, cetriolo piantine sono cresciute al buio, la hypocotyls sono tagliati e congelati a -80 ° C. Hypocotyls congelati sono abrase, appiattito, e poi bloccato a tensione costante in una cuvetta speciale per misure estensimetro. Per misurare l'acido-indotta estensione, le pareti sono inizialmente tamponato a pH neutro, con conseguente bassa attività di espansine che sono componenti delle pareti cellulari native. Al cambio di buffer a pH acido, espansine sono attivate e le pareti cellulari estendere rapidamente. Abbiamo anche mostrato attività espansina in un test di ricostituzione. Per questa parte, usiamo un breve trattamento termico a denaturare le espansine nativo nei campioni di parete cellulare. Queste pareti cellulari inattivato non si estendono anche in tampone acido, ma aggiunta di espansine alle pareti delle cellule ristabilisce rapidamente la loro capacità di estendere.

Protocol

Parte 1: Crescere e stoccaggio di materiale vegetale idoneo

1. Nella nostra esperienza, hypocotyls giovani piantine di cetriolo eziolata servire come comoda fonte di materiale della parete cellulare per questi esperimenti. Semi di cetriolo vengono seminati su carta bagnata in un box a prova di luce, che è conservato in un armadio buio in un ambiente a temperatura costante di 26 ° C. La temperatura esatta non è critica, come qualcosa tra i 22 ° e 30 ° C dovrebbe andare bene, ma la temperatura a determinare la velocità di piantine raggiungere un adeguato livello di sviluppo. Il più caldo la temperatura, più velocemente le piantine si svilupperanno. Usiamo tipicamente piantine quando sono cresciuti di circa 5 cm di lunghezza, che si raggiunge 3-4 giorni dopo la semina. E 'importante che la piantina è cresciuta al buio, in quanto anche piccole quantità di luce influenzano sia il tasso di sviluppo piantina e le proprietà della parete cellulare, che si misura con questa tecnica. Il giorno 3 si può sbirciare nella scatola, con una fioca luce verde filtrata, per controllare lo sviluppo piantina.
2. Piantine si stanno rapidamente tagliate e confezionate in piccole scatole di plastica, 100-150 piantine per scatola, e conservati a -80 ° C. A questa temperatura rimangono utili per settimane.

Parte 2: Preparazione di campioni di parete cellulare

1. Piccoli gruppi (8-10) di piantine taglio congelati sono trasferiti dal congelatore un contenitore isolato contenente un blocco -80 congelatore.
2. La cuticola che copre il ipocotile è abrasa con carborundum. Questo viene fatto ripetutamente il disegno ipocotile tra il pollice e l'indice, che sono rivestiti con un impasto denso di umida polvere carborundum. Ci vuole un po 'di esperienza per conoscere la giusta quantità di pressione da utilizzare: troppa pressione e lo strato epidermico comincia ad essere triturati e lacerato, troppo poca pressione e la cuticola non sarà permeabilizzate. Bisogna anche lavorare velocemente, perché il gelato si scioglie ipocotile, diventa flaccido e difficile da gestire.
3. L'ipocotile abrasa è immerso in acqua ghiacciata per rimuovere la maggior parte del carborundum aderente e poi memorizzati su acqua ghiacciata hypocotyls mentre i rimanenti sono preparati in modo simile.
4. Il hypocotyls sono tagliati alla lunghezza desiderata, di solito 1,2 cm, con una nuova singola lama di rasoio taglio e poi allineati su un vetrino.
5. Ora abbiamo bisogno di appiattire le mura di togliere linfa cellulare e per facilitare la chiusura. Una diapositiva secondo bicchiere è posto sulla parte superiore del gruppo di 8-10 campioni, formando un panino. Un peso (400-500 g) è posto sulla parte superiore del vetrino per 5 minuti. Per il peso che usano abitualmente un bicchiere contenente una quantità adeguata di acqua.
6. Passaggio facoltativo: a seconda della sperimentazione, il hypocotyls può essere inattivato con un breve trattamento termico a questo punto. Per fare questo si legano le diapositive di vetro insieme ad una coppia di elastici, inserire l'assembly in un contenitore con 100 ml di acqua deionizzata a temperatura ambiente e metterla in un forno a microonde alla massima potenza. Con il nostro forno a microonde l'acqua inizia a bollire a circa 50 s e ci fermiamo al microonde 15 s dopo la bollitura ha inizio. L'acqua calda è subito travasato e sostituita con acqua fredda per fermare denaturazione. Potrebbe essere necessario variare questi tempi, come il vostro forno a microonde può essere diversa dalla nostra. Con riscaldamento eccessivo i campioni si indeboliscono e si rompono facilmente. Con un riscaldamento insufficiente il espansina endogeno non viene inattivata ed i campioni di muro conservano alcuni reattività a pH acido.

Parte 3: setup Estensimetro

1. I campioni muro ora sono bloccati in un estensimetro forza costante. Questa è una custom-built dispositivo che consiste in una vaschetta in plexiglas per lo svolgimento del fine basale del campione muro e un morsetto mobile fissato all'estremità apicale del campione. Il morsetto mobile è montata all'estremità di una barra che passa attraverso le bobine aperto di un sensore di posizione, un LVDT o 'differenziali variabili lineari Transformer', che rileva elettronicamente la posizione di un cilindro di metallo, o 'core', che è attaccato alla barra. L'estremità superiore della barra è collegato a una leva con un contrappeso regolabile. Questa leva esercita una quantità regolabile di forza verso l'alto sul campione muro. La forza viene regolata con l'aggiunta o la rimozione dei pesi in metallo calibrato all'estremità della leva.
2. Torna il campione muro - alla fine basale del campione ipocotile viene prelevato con una pinza sottile e ~ 2-3 mm dell'estremità apicale è collocato tra le fauci spalancate del morsetto mobile. Questo morsetto è una molla morsetto a coccodrillo in metallo le cui fauci sono rivestiti di plastica per evitare il contatto diretto tra la superficie metallica e la soluzione tampone e il campione muro. Nella nostra esperienza di ioni metallici può percolare dal morsetto e inibiscono la capacità del muro di estendere, e così teniamo il metallo coperti.
3. Tenendo la pinza di montaggio mobili in una mano, la fine basale del campione muro è ora manovrato tra i due pezzi cerniera della vaschetta in plexiglas e la cuvettapezzi sono riuniti ed avvitato, in modo da bloccare l'estremità inferiore del muro campione nella cuvetta.
4. L'assemblea pinza mobile è ora gentilmente rilasciato, consentendo la piena forza dei contrappesi da trasferire al modello a parete. Noi abitualmente uso di un contrappeso totale di 20 g per i campioni preparati da parete hypocotyls cetriolo. Pareti di materiali o altri esperimenti potrebbe richiedere diversi pesi.
5. La cuvetta è piena di tampone (200 uL) e la posizione della cuvetta spostato verso l'alto o verso il basso con una vite di regolazione, in modo che la pinza mobile è portato al limite inferiore del campo di misura LVDT. Il nostro LVDT è collegato ad una unità di acquisizione dati di un microcomputer, e così abbiamo monitorare la posizione LVDT attraverso il computer. Abbiamo otto assemblee LVDT collegato in parallelo con un computer, che ci permette di eseguire 8 campioni muro simultaneamente. Il computer registra la posizione di ciascuna delle assemblee LVDT una volta ogni 30 s.

Parte 4: risposta estensione di misura a pH acido o espansina - Risultati Rappresentante

1. [Primo esperimento] Per la misura di acido-indotta estensione, iniziamo con i campioni muro nativo (cioè non inattivato con il calore) e tampone neutro viene aggiunto alla cuvetta. I campioni muro si estendono per qualche minuto, in risposta alla tensione aggiunto, ma la decade estensione a un basso tasso dopo pochi minuti. Il nostro computer ci permette di monitorare entrambi la variazione della lunghezza del campione (cioè il cambiamento nella posizione della pinza mobile, dopo l'inizio della sperimentazione) o siamo in grado di monitorare la derivata temporale della posizione, in altre parole il tasso di estensione . Il tasso di estensione si stabilizza ad un valore basso con il tempo.
2. Dopo circa 20 minuti, il buffer neutro viene rimosso. Noi usiamo un tubo di metallo sottile, fatto da un ago ipodermico grande calibro, collegato ad una pompa a vuoto per rimuovere il buffer in modo rapido, con il minimo disturbo della parete o il montaggio meccanico. Tampone acido è poi aggiunto, a volte con 1-2 scambi resoconto di assicurare lo scambio completo di tampone acido. Poi ci sediamo a guardare la risposta del muro. Di solito siamo in grado di rilevare il tasso più veloce di estensione in pochi minuti. Dopo 60 min di solito abbiamo abbastanza informazioni per valutare la risposta di estensione, sebbene in alcuni casi le misurazioni possono estendersi a periodi più lunghi.
3. [Secondo Esperimento] Per la misura di espansina indotta estensione della parete cellulare, si inizia con campioni di siero a muro e con un tampone acido viene aggiunto alla cuvetta. Come nel primo esperimento, il tasso di estensione della parete cellulare stabilizza gradualmente a un valore basso a causa della mancanza di espansina funzionale.
4. Dopo circa 20 minuti, le proteine ​​espansina viene aggiunto alla cuvetta da 'chiodare' con il tampone nella cella con 10-20 uL di una soluzione espansina. Il espansina penetra rapidamente il campione parete cellulare e in pochi minuti si vede che il tasso di estensione è aumentata. Questa risposta estensione può essere seguito per un'ora o più.

Figura 1: Schema di procedure per la preparazione di pareti cellulari per valutare acido-indotta o espansina indotta estensione muro.

Discussion

Per questa dimostrazione abbiamo usato le pareti delle cellule da hypocotyls cetriolo perché hanno dimostrato di essere una fonte affidabile di campioni di muro che sono facili da maneggiare e che rispondono con una buona sensibilità. Abbiamo anche avuto un buon successo con le pareti di altre piantine così come alcuni materiali dal supermercato, come foglie di spinaci giovani e gambi di sedano. In sostanza, giovane, morbido, tessuti vegetali in rapida crescita sono suscettibili di essere facilmente misurato con questa tecnica, ma duro, vecchio, tessuti vegetali ossidato o nongrowing è improbabile che siano sensibili a causa della parete cellulare reticolazione. Ci sono alcune altre cose a diffidare di:

1. Variabilità biologica - anche piantine uniformi dare risposte variabile, per cui un minimo di 5-8 replica è necessario per ottenere risultati statisticamente significativi.
2. Abrasione della cuticola è importante per consentire una rapida penetrazione di buffer e proteine ​​nel campione di parete cellulare. Se la cuticola non è sufficientemente abrasa, le risposte ai buffer acido sarà lenta e mute e le proteine ​​non possono neppure penetrare la cuticola di ottenere una risposta. Alcuni campioni potrebbe non essere necessario all'abrasione, cioè se si utilizzano le bucce epidermico o di altri tessuti sezionati. All'abrasione non uniforme aggiunge una significativa variabilità per i novizi molti.
3. Inattivazione di calore, che viene utilizzato per rimuovere o snaturare espansine endogena, può essere effettuata con altri metodi, ma bisogna trovare la quantità minima di riscaldamento per inattivare espansina endogene al fine di evitare un eccessivo indebolimento e la rottura dei campioni di muro.
4. Espansine sono inclini a inattivazione per ossidazione, quindi 1-5 ditiotreitolo mM nel buffer di solito aiuta a stabilizzare l'attività.
5. L'estensimetro non è un off-the-shelf attrezzatura, ma richiede la costruzione su misura di (a) la cuvetta che contiene il campione muro e (b) la LVDT-clamp-contrappeso di montaggio. L'interfaccia del computer e unità di acquisizione dati non sono essenziali, ma sono particolarmente importanti per l'esecuzione di campioni replicati contemporaneamente e per l'analisi delle curve di ampliamento quantitativo.