酸性pHでとα-エクスパンにより誘起される植物細胞壁の延長（クリープ）を測定

Summary

我々は、酸性バッファーとエクスパンシンタンパク質によって誘導される植物細胞壁の標本の長期延長（クリープ）を測定するために一定の力の伸びの使用例を示します。

Abstract

成長する植物の細胞壁が特徴的に我々は彼らは低^pH（<5）1で、より拡張性のある意味これが"酸成長"、として知られているプロパティを示す。植物ホルモンのオーキシンは急速に酸-成長機構^2、3が少なくとも部分的に若い茎と同様の組織において細胞の伸長を刺激する。オーキシンは細胞壁の溶液の酸性化を引き起こし、原形質膜のH ⁺ポンプを活性化する。壁の酸性化は、細胞の膨圧によって作成された壁の緊張をもたらすために細胞壁を引き起こし、内因性の細胞壁緩み止めタンパク質⁴であるエクスパンシンを、活性化する。その結果、細胞は急速に拡大し始める。この"酸成長"現象は容易に分離された（非生物）の細胞壁の試料で測定されます。酸によって誘発される拡張子を受けるために細胞壁の能力は、単に細胞壁多糖類の構造配置（例えばペクチン）の結果ではなく、エクスパン⁵の活性に依存する。エクスパンシンは、既知の酵素活性を持っていないとエクスパンシン活性のアッセイへの唯一の方法は、細胞壁の拡張子のそれらの誘導を測定することです。このビデオのレポートは、詳細エクスパンシンアッセイに適した壁材を入手する方法と調製技術を、酸誘発性の拡張と成長しているキュウリ胚軸から調製壁のサンプルのエクスパンシン誘発性の拡張子を表示するために行く。

適切な細胞壁のサンプルを入手するには、キュウリの苗を暗所で栽培され、胚軸は-80で切断し、凍結されている℃に冷凍胚軸は、摩耗平らにし、伸びの測定のための特別なキュベットに一定の張力でクランプされています。酸によって誘発される拡張子を測定するために、壁には、最初にネイティブの細胞壁の成分であるエクスパンシンの活性が低い、その結果、中性のpHで緩衝化されています。酸性pHに緩衝液交換時には、エクスパンシンが活性化し、細胞壁は、急速に拡張されています。我々はまた、再構成アッセイにおけるエクスパンシンの活性を示す。この部分については、我々は、細胞壁のサンプルでネイティブエクスパンシンを変性させる簡単な熱処理を使用してください。これらの不活化細胞壁は、酸性緩衝液でも拡張しませんが、細胞壁のエクスパンシンの添加は、急速に拡張する能力を復元します。

Protocol

パート1：成長と適切な植物材料を保存する

1. 我々の経験では、黄化キュウリの苗から若い胚軸は、これらの実験のための細胞壁物質の便利な供給源として働く。キュウリの種子は26で設定された恒温室で暗いキャビネットに保管され遮光ボックス、℃で湿紙に播種されていますC正常な状態になる22 °と30 °の間に何と正確な温度は、重要ではないが、温度は苗が開発の適切な段階に到達する速度が決定されます。周囲の温度になじませ、より高速な苗が開発します。我々は、典型的には3-4日播種後に到達する長さは5 cm程度に成長した苗を使用してください。光の少量であっても我々はこの手法で測定することを苗の開発の速度と細胞壁のプロパティの両方に影響を与えるとして、苗を暗所で栽培することが重要です。 3日目には苗の開発をチェックするために、薄暗い緑のフィルタリングライトを使用して、ボックス内のpeekすることができます。
2. 苗は、急速にカットし、小さなプラスチックの箱、箱当たり100〜150本の苗木に詰め、そして-80℃で保存されていますこの温度で​​は、彼らは数週間のための有用なままである。

第2部：準備の細胞壁のサンプル

1. 冷凍カット苗の小グループ（8-10）は、冷凍庫から-80冷凍ブロックを含む断熱容器に転送されます。
2. 胚軸をカバーするキューティクルはカーボランダムで摩耗しています。これは、繰り返しウェットカーボランダム粉末の厚さのスラリーでコーティングされている親指と人差し指の間の胚軸を描画することによって行われます。それは、使用する圧力の正しい量を知るには少し経験が必要です。すぎる圧力と表皮層が細断処理と引き裂かれたように開始します。少なすぎる圧力とキューティクルが浸透されることはありません。一つは、また、冷凍胚軸融解と、それが管理する弛緩性と、ハードになるのですぐに仕事をしている。
3. 残りの胚軸は同様の方法で調製されている間に磨耗した胚軸を氷水上に格納して付着カーボランダムとのほとんどを除去するために氷水に浸漬する。
4. 胚軸は、新しい単一の両刃カミソリの刃で、通常1.2センチメートル、希望の長さに切断し、スライドガラス上に整列されています。
5. 今、私たちは、細胞の樹液を削除するとクランプ容易にするために壁を平らにする必要があります。第2のガラススライドは、サンドイッチを形成する、8-10サンプルのグループの上に配置されます。重量（400-500 g）を5分間スライドガラスの上に配置されます。重量のために我々は日常的に適量の水を入れたビーカーを使用してください。
6. オプションの手順：実験に応じて、胚軸はこの時点で短時間の熱処理で不活化されることがあります。これを行うために、我々は、ガラス、ゴムバンドのペアと一緒にスライド結合し、室温で脱イオン水100 mLの容器にアセンブリを配置し、フルパワーで電子レンジに入れてください。私たちの電子レンジで水は約50秒で沸騰し始め、沸騰が開始した後我々はマイクロ波の15秒を停止する。お湯はすぐにオフ注ぎ、変性を停止するために冷たい水に置き換えられます。あなたのマイクロ波が私達のものとは異なる可能性があるように、これらのタイミングを変化させる必要があります。過度の加熱により試料が弱くなり、簡単に壊れる。不十分な加熱で内因性のエクスパンシンが失活し、壁の試料は酸性pHにいくつかの応答性を保持されていません。

パート3：伸び計のセットアップ

1. 壁のサンプルは現在、一定の力の伸びにクランプされています。これは、壁のサンプルとサンプルの先端部に取り付けられた可動クランプの基端を保持するためのプレキシグラスのキュベットで構成されるカスタム構築されたデバイスです。可動クランプの位置センサのオープンコイルを通過するロッドの端にマウントされている、LVDTまたは電子的に小さな金属製のシリンダーの位置を検出する"リニア可変差動トランス"、、または"コア"は、ですロッドに装着。ロッドの上端部は、調節可能なおもりでレバーにリンクされています。このレバーは、壁のサンプル上に上向きの力の調整可能な量を発揮する。力は、レバーの遠端に校正された金属製のウェイトを追加したり削除したりして調整されます。
2. 後壁のサンプルへ - 胚軸サンプルの基端は、微細な鉗子でピックアップされており、先端部の2〜3 mmの可動クランプのオープンジョーとの間に配置されます。このクランプは、その金属ジョーが金属表面と緩衝液または壁のサンプル間の直接接触を防止するためにプラスチックでコーティングされているバネ仕掛けのワニクランプです。私たちの経験の金属イオンに延び、そして私たちは金属のカバーを維持するために壁の能力を阻害クランプから浸出がとができます。
3. 片方の手で可動クランプアセンブリを保持している、壁の試験片の基端は、現在プレキシグラスキュベットとキュベットの二つヒンジ片の間に操縦されているピースが結集し、それによりキュベットで壁のサンプルの下端をロック、タイトネジ止めされる。
4. 可動クランプアセンブリは、おもりの完全な力が壁の試料に転送できるように、今ゆっくりと放出される。我々は日常的にキュウリ胚軸から調製壁のサンプルを20 gの合計カウンターウェイトを使用してください。他の壁材や実験は、異なる重みを必要とする場合があります。
5. キュベットは、バッファーで満たさ（200 UL）とキュベットの位置は、可動クランプがLVDT測定範囲の下端に持って来られるように、調節ネジで上下に移動されます。私たちのLVDTは、我々がコンピュータを介してLVDTの位置を監視するため、マイコンのデータ収集ユニットに接続され、。私たちは、私たちは同時に8壁のサンプルを実行することを可能にする一台のコンピュータに並列に接続した8 LVDTアセンブリを、持っている。コンピュータごとに1回LVDTアセンブリの各30秒の位置を記録

パート4：酸性pHまたはエクスパンシンの測定の拡張レスポンス - 代表的な結果

1. [最初の実験]酸誘発拡張子の測定には、我々は、ネイティブの壁のサンプルから始める（つまり、熱で失活しない）と中性緩衝液をキュベットに追加されます。壁のサンプルが追加された緊張に反応して、数分間延長するが、数分後に低レートへの拡張が減衰する。私たちのコンピュータは、私たちは、いずれかのサンプルの長さの変化を監視する（つまり、実験開始後、可動クランプの位置の変化）や我々が他の言葉で、拡張子の率を位置の時間微分を監視できることができます。伸長率は、時間と低い値で安定します。
2. 〜20分後、中性緩衝液は削除されます。私たちは壁の軽微な障害または機械的なアセンブリと、すぐにバッファを削除するには、真空ポンプに接続されている大規模なゲージの注射針から作られた薄い金属パイプを、使用してください。酸性緩衝液は、酸性バッファーに完全な交換を保証する1-2クイック取引所で時々、追加されます。その後、我々は後ろに座ると壁の応答を監視します。一般的に我々は数分で拡張子のより速い速度を検出することができます。いくつかのケースでは測定が長時間に伸びるかもしれないが60分後、我々は通常、拡張子の応答を評価するのに十分な情報があります。
3. [第二実験]エクスパンシン誘発性の細胞壁の拡張子の測定では、我々は、熱不活化の壁のサンプルと酸性緩衝で始まるをキュベットに追加されます。最初の実験と同様に、細胞壁の延長率は徐々にために機能的なエクスパンシンの欠如の低い値で安定します。
4. 〜20分後、エクスパンシンタンパク質は、エクスパンシンソリューションの10-20 ULでキュベット内のバッファに"スパイク"でキュベットに追加されます。エクスパンシンは、急速に細胞壁のサンプルを貫通して数分以内に我々は、伸長率が増加していることがわかります。この拡張子の応答は、時間以上続けることができます。

図1：酸誘発またはエクスパンシン誘発性の壁の拡張子を評価するために細胞壁を準備する手順の概要。

Discussion

は、扱いやすい、それは良い感度で応答壁のサンプルの信頼できるソースであることが証明しているので、このデモのために我々は、キュウリ胚軸から細胞壁を使用。我々はまた、若いほうれん草の葉、セロリの茎などスーパーマーケットから他の苗だけでなく、いくつかの材料、から、壁との良好な成功を収めている。基本的に、若い、柔らかい、急速に成長している植物組織は簡単にこのテクニックを用いて測定される可能性が高いが、タフな、古い、酸化またはnongrowing植物組織が原因細胞壁架橋の反応がないことになる。用心にいくつか他のものがあります。

1. 生物学的変動 - であっても均一な苗が変数の応答を与えるので、5-8の最小値は、複製には、統計的に意味のある結果を得るために必要です。
2. キューティクルの摩耗は、細胞壁の試料に緩衝液と蛋白質の急速な浸透を可能にすることが重要です。キューティクルが十分に削られていない場合は、酸性緩衝液への応答が遅いとミュートになり、タンパク質は、さらに応答を引き出すためにキューティクルに浸透しないことがあります。いくつかのサンプルでは、​​表皮の皮やその他の解剖組織を使用する場合、すなわち、摩耗を必要としない場合があります。不均一に摩耗は多くの初心者のための有意な変動が追加されます。
3. 内因性のエクスパンシンを削除したり変性するために使用される熱不活化は、、他の方法により行うことができるが、一つのニーズは、壁の試料の過度の弱体化や破損を避けるために内因性のエクスパンシンを失活させる加熱の最小量を見つけるために。
4. エクスパンシンは、酸化による不活化しやすい、バッファのように1から5 mMジチオスレイトールでは、通常の活動を安定させるのに役立ちます。
5. 伸び計は、機器の既製の部分ではなく、壁の試料と（b）LVDTクランプ - カウンターウェイトアセンブリを保持している（a）のキュベットのカスタム構築する必要があります。コンピュータのインターフェースやデータ取得部は必須ではありませんが、同時に複製サンプルを実行するための、定量的に拡張曲線の分析に特に有用です。