Summary
Intravital और Dendra2 लेबल स्तन इमेजिंग खिड़की के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं के photoswitching ट्रैकिंग तकनीक है जो हमें दिनों के एक timescale पर चुना ट्यूमर microenvironments में ट्यूमर कोशिकाओं के metastatic व्यवहार की छवि करने की अनुमति देता है.
Abstract
पिछले दशक में, एकल कोशिका संकल्प में चूहों और चूहों में स्तन ट्यूमर के intravital माइक्रोस्कोपी
Protocol
1. फ्लोरोसेंट स्तन वसा पैड में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन का उपयोग ट्यूमर के जनरेशन:
- 80% confluency - एक सेल लाइन 40 से Dendra2 प्रोटीन (एक cytoplasmic मार्कर के रूप में) व्यक्त हो जाओ.
- व्यंजन पीबीएस w / ओ 2 Ca के साथ कम से कम 3 बार कुल्ला + या 2 मिलीग्राम + .
- प्रति 10 सेमी पकवान और सेते 37 trypsin के 3 मिलीलीटर जोड़ें डिग्री सेल्सियस तक कक्षों की सबसे अलग और फिर इसे हिला एक फ्लैट सतह के खिलाफ पकवान मारा.
- पकवान बंद सभी कोशिकाओं कुल्ला, और मैट्रिक्स के रूप में अच्छी तरह से इकट्ठा एक खुरचनी (रबड़ पुलिसकर्मी) का उपयोग करें. पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें. एक विभाज्य लो centrifugation के दौरान गिनती.
- 5 मिनट के लिए 800 ग्राम अपकेंद्रित्र.
- Aspirate और पीबीएस में 5 के एक एकाग्रता के लिए resuspend - 10x मिलीलीटर 6 / 10. बर्फ पर स्टोर जब तक इंजेक्शन (इंजेक्षन 30 मिनट के भीतर).
- एक बाँझ हुड के अंदर 4-5 सप्ताह पुरानी महिला प्रतिरक्षा चूहों की कमी (जैसे SCID) युक्त पिंजरे रखें.
- 70% इथेनॉल के साथ 4 निपल (उदर) के आसपास के क्षेत्र स्प्रे.
- स्तन वसा पैड में 0.1 मिलीलीटर इंजेक्षन. यदि एक सहायक पाया जा सकता है है, जगह में एक व्यक्ति माउस पकड़ कर सकते हैं जबकि अन्य आवेषण स्तन वसा पैड अंदर सुई. यदि आप अपने द्वारा इंजेक्शन हैं, संज्ञाहरण के तहत प्रकाश माउस डाल isoflurane का उपयोग.
- एक बार ट्यूमर 5-7 मिमी हो गई है, स्तन इमेजिंग विंडो (MIW) डाला जाना चाहिए.
नोट: वैकल्पिक रूप से, कुछ अनुप्रयोगों के लिए, MIW स्वस्थ स्तन वसा पैड के शीर्ष पर डाला जा सकता है और कोशिकाओं को बाद में इंजेक्ट किया जा सकता है. दृष्टिकोण है कि एक मनोवैज्ञानिक वातावरण में transiently ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की इमेजिंग की अनुमति देता है.
2. स्तन इमेजिंग विंडो (MIW) के मैनुअल निर्माण:
- MIWs (चित्रा 1 ए) ऊतक ग्रेड प्लास्टिक के बने होते हैं biocompatibility गारंटी. मैनुअल निर्माण के लिए, हम 5 या 10 सेमी व्यंजन का उपयोग करें.
- लाटेकस दस्ताने पर रखो.
- एक ऊतक संस्कृति पकवान गर्मी और गरम डिश (हम इस के लिए एक 1 इंच dremmel बिट का उपयोग करें) के खिलाफ एक गोल, हार्ड वस्तु धक्का द्वारा एक घुमावदार सतह creat.
- एक गरम धार का उपयोग पकवान की केंद्र से बाहर कट.
- गुंबद के आकार का प्लास्टिक के आधार (व्यास में 6-7mm) के केंद्र में एक छेद बनाने के एक छोटे से, शंकु के आकार का dremmel बिट का उपयोग करने के लिए.
- प्लास्टिक आधार के किनारों को पूरी तरह dremmel साथ sanding और भविष्य में इसे दाखिल चिकनी.
- प्लास्टिक आधार बनाने गिलास coverslip के लिए एक फ्लैट सतह के ऊपर फ़ाइल. दायर, फ्लैट सतह के 9-10mm व्यास होना चाहिए.
- गोंद 8mm परिपत्र चपटा superglue का उपयोग सतह पर कांच (संख्या 1) coverslip (cyanoacrylate चिपकने).
- सूखी गोंद (15 मिनट) के लिए रुको.
- एक गर्म 26G सुई का प्रयोग करने के लिए आठ suturing छेद बाहर (जहाँ गिलास है) आधार के अंदर puncturing. छेद coverslip चारों ओर समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए coverslip के किनारे से दूर 0.5 1mm.
- एक 5-0 suturing सुई का उपयोग छेद चौड़ा.
- प्लास्टिक के आधार में छेद puncturing भीतरी सतह असमान कर देगा. रेत कागज का प्रयोग, यह पूरी तरह से चिकनी सतह बनाने के.
- दस्ताने और एक छोटा सा ब्रश का उपयोग MIW से छोटे प्लास्टिक के कणों के ब्रश बदलें.
- विआयनीकृत जल के साथ MIW धो लें.
- 70% इथेनॉल का उपयोग MIW धो लें. एक क्यू की नोक का प्रयोग कांच साफ तो यह पूरी तरह से पारदर्शी है. यदि धूमिल गोंद वाष्प से वर्तमान धब्बे होते हैं, एक क्यू की नोक के साथ सावधानी एसीटोन उपयोग.
- प्रत्येक पक्ष पर 3 घंटे के लिए यूवी जोखिम से MIW जीवाणुरहित.
स्तन इमेजिंग विंडो (MIW) के निर्माण अर्ध मैनुअल:
आदेश में प्लास्टिक आधार बनाना, हम वर्तमान में सिलिकॉन रबर molds कास्टिंग का उपयोग कर रहे हैं हाथ बनाया MIWs का उपयोग कर बनाया. मोल्ड सिलिकॉन रबर के दो भागों है कि दोनों के सामने और वापस मूल जब पॉलिएस्टर राल के साथ भर और फिर तुरंत एक साथ शामिल हो गए का एक सटीक प्रतिकृति बनाने के शामिल है. तरल पॉलिएस्टर राल 9:10 के साथ मिलाया जाता है और जब पूरी तरह से 48h में ठीक एक हार्ड संरचना में परिणाम. प्लास्टिक यूवी संरक्षित और टूट या समय के साथ पीले बनने के बिना अभिलेखीय है.
आधार के बाद ठीक हो जाता है कदम 2.8-2.16 मैन्युअल बनाया MIWs के लिए के रूप में उसी तरह किया जाता है.
3. निवेशन के MIW:
- 4 वें निप्पल के आसपास के क्षेत्र में एक छोटे (5-7 मिमी व्यास) ट्यूमर होना चाहिए कई दिन / सप्ताह ट्यूमर कोशिका प्रकार (चित्रा 1 बी) के आधार पर कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद. Dendra2 photoswitchable प्रोटीन या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद इस्तेमाल किया सेल लाइन पर निर्भर करता है कितना समय बीत चुका है. ट्यूमर दिख परिगलित नहीं हो, और ट्यूमर के शीर्ष पर बालों के साथ एक अक्षुण्ण त्वचा होना चाहिए चाहिए. परिगलित ट्यूमर के साथ चूहे euthanized किया जाना चाहिए.
- के लिए बाँझ अंतरिक्ष नीचे एक बाँझ हुड के अंदर बाँझ कपड़े का एक टुकड़ा तैयार सर्जरी करना. बाँझ जी का एक टुकड़ा रखोबीच में auze, और इसके चारों ओर कुछ MIWs और बाँझ वाद्ययंत्र रखना: हम छोटे मानक कैंची, वसंत कैंची, microdissecting चिमटी, microdissecting संदंश, सुई धारक का उपयोग करें. बाँझ क्यू युक्तियाँ, 70% इथेनॉल और डाकू के कोने में बाँझ दस्ताने की एक बोतल रखें.
- माउस बाँझ हुड में anesthetized HBSS में 2.5% AVERTIN (20 μl / छ) के आईपी इंजेक्शन का उपयोग कर या, वैकल्पिक रूप से 10 ketamine μg किग्रा / 10 μg / छ + xylazine (अनुमोदन और आदेश के लिए अपने जानवर की देखभाल संस्थान से संपर्क करें).
नोट: Avertin समाधान तैयार किया जाना चाहिए द्वि - साप्ताहिक, फिल्टर का उपयोग कर एक 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर और 4 में 500 μl aliquots के रूप में संग्रहीत निष्फल डिग्री सेल्सियस (अंधेरे में). - ट्यूमर से ऊपर एक छोटे जानवर शेवर का उपयोग कर हजामत बनाने का काम क्षेत्र द्वारा बाल निकालें.
- नायर बालों को हटाने क्रीम (किसी भी दवा की दुकान में उपलब्ध) का उपयोग कर बालों के बाकी निकालें. इथेनॉल डूबा क्यू सुझावों का उपयोग कर त्वचा साफ.
- बाँझ धुंध पर जानवर स्थानांतरण और आंखों को नेत्र मरहम लागू करने के लिए उन्हें सुखाने और संक्रमण से रखने.
- Betadine साथ त्वचा जीवाणुरहित और 70% इथेनॉल के साथ साफ.
- बाँझ हुड के अंदर एक बाँझ शल्य चिकित्सा कपड़ा पर जानवर स्थानांतरण.
- त्वचा तुरंत त्वचा में संदंश और कटौती ~ 2mm चीरा का उपयोग निपल को औसत दर्जे का खींचो.
- विच्छेदन कैंची और संदंश का उपयोग कर त्वचा से अलग अंतर्निहित स्तन वसा पैड. त्वचा और छेद खिंचाव इस जुदाई चरण के दौरान एक आकार है कि MIW की प्रविष्टि को समायोजित करेगा.
- यदि accidently एक पोत sugery के दौरान मारा है, एक बाँझ क्यू युक्तियों का उपयोग करें कि उत्पादन / अत्यधिक बनने से रक्तस्राव को रोकने के लिए किसी भी रक्त निकालने.
- ऐसी है कि वहाँ MIW आधार और सिवनी के शीर्ष पर जगह में त्वचा गैर absorbable धागे का उपयोग कर और सुई काटने रिवर्स MIW डालें.
- चिपकने वाला ऊतक या cyanoacrylate suturing छेद में भरने के लिए और त्वचा के लिए सुरक्षित MIW का उपयोग करें.
- TMP-एसएमएक्स एंटीबायोटिक मिश्रण जोड़ें: (Sulfamethoxazole 0.6 मिलीग्राम / एमएल, Trimethoprim 0.12 मिलीग्राम / एमएल) के पहले और सर्जरी के बाद तीन दिनों के लिए पिंजरे पानी की बोतल में.
- जानवर 1-4 के लिए संज्ञाहरण के तहत AVERTIN आईपी इंजेक्शन के बाद रहता है. चूंकि सर्जरी सामान्यतः 45min ~ लेता है, यह महत्वपूर्ण है मदद करने के लिए पशु बाद पुनर्प्राप्त:
- एक हाथ हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पिंजरे के तल पर (drugstores में उपलब्ध) प्लेस और यह धुंध के साथ कवर.
- पैड के शीर्ष पर पशु रखें जब तक वह अपने पेट पर बदल जाता है और चलने शुरू होता है.
- यदि पशु 3h की तुलना में अधिक के लिए बेहोश है, पुनर्जलीकरण के लिए HBSS intraperitoneally के 0.3 मिलीलीटर इंजेक्षन.
- जानवर करने के लिए अगले 3-4 दिनों में ठीक हो पहली इमेजिंग सत्र से पहले जगह लेता है की अनुमति दी है.
4. इमेजिंग बॉक्स निर्माण
इमेजिंग बॉक्स का आश्वासन दिया है कि MIW फ्लैट बैठा है खुर्दबीन उद्देश्य के ठीक ऊपर. यह भी isoflurane की निरंतर airflow के माध्यम से तापमान और संज्ञाहरण नियंत्रण की सुविधा है. बॉक्स plexiglass से बना है और एक साथ चिपके प्लास्टिक वेल्ड का उपयोग. यह विशिष्ट खुर्दबीन चरण के लिए फिट है और इसलिए इसके नीचे के आकार इस्तेमाल किया सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 2 Leica SP5 खुर्दबीन चरण के लिए फिट बॉक्स की योजना से पता चलता है) के आधार पर बदलता रहता है.
सेंटीमीटर में बॉक्स के आयाम कर रहे हैं l = 11.4 सेमी, डब्ल्यू = 7.6 सेमी, ज = 4.4 सेमी (2A चित्रा). बॉक्स के नीचे एक खोखले प्लेट, आकार में 12.7x8.4 सेमी, जो Leica SP5 खुर्दबीन मंच के अंदर फिट बैठता है और दो स्लाइडिंग "दरवाजे" एक्स 5.7, 5.7 cm_each, जो एक परिपत्र (खोलने के फार्म के होते हैं घ = 2.22 सेमी ) जब बंद कर दिया. MIW इस खोलने में फिट बैठता है. सामने टुकड़ा संज्ञाहरण प्रसव के लिए प्रवेश छेद होता है, जबकि एक पक्ष टुकड़े की एक दुकान का छेद है जो निर्वात की ओर जाता है शामिल हैं.
ध्यान दें कि संघनित्र और स्लाइड धारक से पहले इमेजिंग बॉक्स प्लेसमेंट के लिए हटा दिया जाना चाहिए.
5. इमेजिंग बॉक्स का उपयोग करें
- Isoflurane साथ संज्ञाहरण के तहत पशु प्लेस और आंखों को नेत्र मरहम लागू.
- संज्ञाहरण मशीन से इमेजिंग बॉक्स सामने इनलेट छेद (चित्रा 2B) के बाहर पर isoflurane निकास संलग्न.
- इमेजिंग बॉक्स की दुकान का छेद करने के लिए एक दूसरे ट्यूब संलग्न. इस ट्यूब गैस फिल्टर करने के लिए और फिर वैक्यूम करने के लिए संलग्न किया जाना चाहिए.
- बॉक्स के ढक्कन को खोलें और बॉक्स दरवाजे खुले और पशु, MIW नीचे का सामना करना पड़ पक्ष जगह है, और बॉक्स में दरवाजे स्लाइडिंग.
- बॉक्स पकड़ो और नीचे दरवाजे ताकि MIW आधार आयोजित किया है और उन दोनों के बीच स्थिर समायोजित. MIW आधार इमेजिंग बॉक्स दरवाजे के रूप में एक ही स्तर पर हो सकता है, जबकि MIW coverslip सिर्फ इस स्तर से नीचे कुछ मिलीमीटर होना चाहिए. सुनिश्चित करें कि नीचे के बीच MIW दरवाजे स्लाइडिंग की स्थिति सुनिश्चित करता है कि coverslip (MIW के गिलास भाग) फ्लैट झूठ नीचे बॉक्स दरवाजे करने के लिए समानांतर. यह उचित ध्यान केंद्रित सुनिश्चित करेगा.
- कम खुर्दबीन उद्देश्य के बॉक्स के स्थान के लिए अंतरिक्ष पर अनुमतिखुर्दबीन मंच के ऊपर.
- खुर्दबीन मंच पर बॉक्स प्लेस, और मंच समायोजित इतना है कि MIW coverslip उद्देश्य से ऊपर है.
- उद्देश्य फोकस और इमेजिंग शुरू.
- जबकि isoflurane का उपयोग, पशु श्वास आवृत्ति के दृश्य निरीक्षण द्वारा निगरानी की जानी चाहिए. यह नेत्रहीन किया जा सकता है या श्वास इमेजिंग संग्रह (इन डाटा अधिग्रहण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं) के दौरान प्रदर्शित होने कलाकृतियों की आवृत्ति की निगरानी के द्वारा. MouseOx नाड़ी oximetry प्रणाली (स्टार जीवन विज्ञान कॉर्प) सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. इस तरह के डेटा पर रोशनी कमरे में जानवर पर जांच मोड़ के बिना लगातार इकट्ठा कर सकते हैं.
नोट: प्रत्येक इमेजिंग सत्र के बाद, पशु वसूली धुंध या kimwipes में एक छोटे से हाथ हीटिंग पैड लपेटकर और जानवर के तहत इसे पिंजरे में डाल द्वारा मदद किया जाना चाहिए.
नोट: यदि एक विसर्जन उद्देश्य MIW के माध्यम से छवि के लिए प्रयोग किया जाता है, विसर्जन मध्यम (ग्लिसरॉल, पानी, तेल) से साफ किया जाना चाहिए इमेजिंग खिड़की. MIW किसी भी दरारें या अन्य नुकसान है कि इमेजिंग के दौरान हुई हो सकता है के लिए निरीक्षण किया जाना चाहिए. यह एकाधिक इमेजिंग सत्र के दौरान डेटा इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है.
6. Photoswitching और Dendra2 लेबल की कोशिकाओं के इमेजिंग
प्रक्रिया Leica SP5 confocal खुर्दबीन के लिए वर्णित है, फोकल हवाई जहाज़ पर लेजर बिजली उपलब्ध उद्देश्यों और सॉफ्टवेयर विकल्प जब अन्य confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर या multiphoton इमेजिंग स्थापित भिन्नता है, और इसलिए प्रोटोकॉल नीचे वर्णित एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए करने के लिए अनुकूलन अपने खुर्दबीन पर प्रयोग.
- हरी प्रतिदीप्ति फिल्टर के साथ ऐपिस (10x) के माध्यम से ट्यूमर को देख कर, प्रमुख रक्त वाहिकाओं जो दिख बह रही हैं और एक ही फोकल हवाई जहाज़ में फ्लैट बिछाने का पता लगाने.
- एक क्षेत्र और PMT पता लगाने के लिए स्विच के केंद्र में जहाजों की स्थिति.
- दो चैनलों के लिए अनुक्रमिक इमेजिंग संग्रह सेट. चैनलों की 488nm लेजर लाइन (10% बिजली) का उपयोग करता है, और कोशिकी (480 - 495nm) Dendra2 (505 - 540nm) के हरे रूप से मैट्रिक्स और उत्सर्जन से बिखरने एकत्र. दूसरे चैनल 543nm लेजर लाइन (90% बिजली) का उपयोग करता है और Dendra2 के लाल प्रपत्र (555 - 600nm) से उत्सर्जन एकत्र है. 3D पूर्व photoswitching छवियों लीजिए.
- आरओआई स्कैन 405nm लेजर लाइन की (30% बिजली, 20-40 स्कैन) का उपयोग कर कक्षों की एक चुना जनसंख्या photoswitch विकल्प का प्रयोग करें. लीजिए प्रोटीन की लाल फार्म के उत्सर्जन करने के लिए स्विचन की निगरानी.
- 6.3 में एक ही अनुक्रमिक दिनचर्या का प्रयोग, पोस्ट स्विचन 3 डी छवियों को इकट्ठा.
- यदि ट्यूमर में एक से अधिक क्षेत्र photoswitching, यह दोनों हरे और लाल चैनल (चित्रा 3 ए, बी) में एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर oculars के माध्यम से तस्वीरें लेने की सलाह दी है. बाद इमेजिंग सत्र के दौरान इस उन्मुखीकरण में मदद मिलेगी.
नोट: इसके अलावा, रक्त वाहिकाओं अस्थायी रूप से फ्लोरोसेंट dextran (झरना ब्लू या Alexa 647 Fluor, 10kDa दोनों) की पूंछ नस इंजेक्शन का उपयोग लेबल कर सकते हैं. इंजेक्शन के बाद कुछ घंटे, dextrans रक्त वाहिकाओं छोड़ने के लिए और स्थायी रूप से मैक्रोफेज लेबल होगा.
प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 3C एक आयताकार photoswitched क्षेत्र (लाल) orthogonally उन्मुख रक्त वाहिका (कोई प्रतिदीप्ति) रिश्तेदार से पता चलता है. गैर photoswitched कोशिकाओं को हरा कर रहे हैं, जबकि बाह्य मैट्रिक्स से बिखरने बैंगनी है. छवि z अक्ष (20-50 सुक्ष्ममापी गहराई) के साथ एक चार छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण है.
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Acknowledgments
(; CA100324 जे.सी., JES और JW, U54GM064346 JvR CA77522 JES, U54CA126511 जे.सी. और बीजी तक) यह काम अमेरिकी रक्षा विभाग (BC075554 बीजी और BC061403 डी.के. करने के लिए), अमेरिका के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. हम माइक्रोस्कोपी इमेजिंग बॉक्स और F4/80 एंटीबॉडी के लिए जे पोलार्ड (मेडिसिन के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज) के निर्माण में मदद के लिए एम. Rottenkolber के साथ मदद के लिए डी. Entenberg धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS w/o Ca, Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| SCID mouse | National Cancer Institute | N/A | |
| Culture dishes | BD Biosciences | 353003 | Custom Order |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
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