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Biology

내유 이미징 창문 Dendra2 Photoswitching

Published: June 5, 2009 doi: 10.3791/1278
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2, 1,2,3
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University, 2Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University, 3Hubrecht Institute-KNAW and University Medical Center Utrecht

Summary

내유 이미징 창을 통해 Dendra2 - 라벨 종양 세포의 Intravital photoswitching 및 추적은 우리가 이미지 일 timescale 이상 선택 종양의 microenvironments에서 종양 세포의 전이성 동작을 수있는 기술입니다.

Abstract

단일 셀 해상도 마우스 및 쥐의 유방 종양의 지난 10 년, intravital 현미경

Protocol

1. 내유 지방 패드로 종양 세포의 주입을 사용하여 형광 종양의 생성 :

  1. 80% confluency - 40 Dendra2 단백질 (세포질 마커 등) 표현 세포 라인을 성장.
  2. PBS w / O 칼슘 2 요리 적어도 3 번 린스 + 또는 MG 2 +.
  3. 37 10cm 요리와 부화 당 트립신 3 ML 추가 ° C 세포의 대부분은 분리하고 그것을 흔들 수있는 평면에 대한 접시를 나오기 전까지.
  4. 접시에서 모든 세포를 씻어하고,뿐만 아니라 매트릭스를 수집하는 스크레이퍼 (고무 경찰관)을 사용합니다. PBS의 5 ML을 추가합니다. 원심 분리하는 동안 셀 나누어지는 가져가라.
  5. 5 분 800g에 원심 분리기.
  6. 기음 5의 농도로 PBS에 resuspend - 10X 10 6 / ML. (30 분 이내에 주입) 주입까지 얼음에 보관하십시오.
  7. 멸균 후드 안쪽 4~5주 오래된 여성 면역 결함 쥐 (예 : SCID)이있는 케이지를 놓습니다.
  8. 70 % 에탄올과 함께 4 (복부) 유두 주변을 스프레이.
  9. 내유 지방 패드로 0.1 ML를 주사. 보조를 찾을 수있다면, 한 사람이 자리에 마우스를 저장할 수있는 동안 다른 삽입 내유 지방 패드 내부에 바늘. 당신이 직접 주입하는 경우, isoflurane을 사용 빛을 마취에서 마우스를 넣어.
  10. 종양이 5~7밀리미터로 성장하였습니다되면, 내유 이미징 창 (MIW)를 삽입해야합니다.
    참고 : 또는 일부 응용 프로그램에 대한, MIW이 건강 내유 지방 패드의 상단에 삽입될 수 있으며, 세포가 나중에 주입 수 있습니다. 그 접근 방식은 생리적 환경에서 transiently transfected 세포의 이미징 수 있습니다.

2. 내유 이미징 창 (MIW)의 매뉴얼 제작 :

  1. MIWs (그림 1A)는 biocompatibility를 보장하기 위해 조직 등급 플라스틱 만들어집니다. 수동 건설, 우리는 5 10cm 요리를 사용합니다.
  2. 에 라텍스 장갑을 넣어.
  3. 조직 문화 요리를 가열하고 온수 요리 (우리는 이것에 대한 1 인치 dremmel 비트를 사용)에 대한 둥근 하드 개체를 추진하여 곡선 표면을 creat.
  4. 온수 면도날을 사용하여 요리의 중심을 잘라 버릴거야.
  5. 돔 모양의 플라스틱베이스 (지름 6-7mm)의 중앙에 구멍을 만들기 위해 작은 원추 모양의 dremmel 비트를 사용합니다.
  6. dremmel으로 샌딩하고 더욱 그것을 제출하여 플라스틱베이스의 가장자리가 완전히 부드럽게합니다.
  7. 유리 coverslip에 대한 평면을하는 플라스틱베이스의 상단을 파일입니다. 제기, 평면의 직경 9-10mm해야합니다.
  8. superglue를 사용하여 평평 표면에 접착제 8mm 원형 유리 coverslip (숫자 1) (cyanoacrylate 접착제).
  9. 건조에 접착제 (15 분) 기다립니다.
  10. 베이스의 내부에 외부 (유리가 어디)에서 펑쳐링 팔 suturing 구멍을 만들기 위해 가열 26G 바늘을 사용합니다. 구멍이 고르게 0.5 - 1mm 떨어진 coverslip의 가장자리에서, coverslip 주위에 배포해야합니다.
  11. 5-0 suturing 바늘을 사용하여 구멍을 넓혀.
  12. 플라스틱베이스에 구멍을 펑쳐링하면 안쪽 표면이 울퉁불퉁하게됩니다. 모래 종이를 사용하여,이 표면이 완전히 부드럽게합니다.
  13. 작은 브러시를 사용하여 MIW에서 작은 플라스틱 입자의 장갑과 칫솔을 변경합니다.
  14. 탈이온수로 MIW 씻으십시오.
  15. 70 % 에탄올을 사용하여 MIW 씻으십시오. 완전히 투명하므로 유리를 청소하는 Q - 팁을 사용하십시오. 접착제 증기에서 현재 안개 장소가있다면, Q - 팁과 아세톤을 신중하게 사용합니다.
  16. 양쪽 3 H에 대한 UV 노출에 의해 MIW를 소독.

: 내유 이미징 창 (MIW)의 세미 매뉴얼 제작

플라스틱베이스를 조작하기 위해, 우리는 현재 실리콘 고무 주조 금형을 사용하는 것은 손으로 만든 MIWs을 사용하여 만들었습니다. 금형은 즉시 모여 다음 폴리 에스테르 수지 가득 다시 원래의 전면과 모두의 정확한 복제를 실리콘 고무의 두 부분으로 구성되어 있습니다. 액체 폴리 에스테르 수지 함께 9시 10분 혼합하여 완전히 48h에서 치료 어려운 구조 검색 결과입니다. 플라스틱은 파괴하거나 시간이 지남에 따라 노란색으로 된하지 않고 자외선 보호 및 보존됩니다.
기본이 치료되면 2.8-2.16 수동으로 만든 MIWs과 동일식으로 단계를 반복합니다.

3. MIW 삽입 :

  1. 4 번째 유두 주변 지역은 소형 (5-7 당연 직경) 종양이 있어야합니다 몇 일 / 주 세포 유형 (그림 1B)에 따라 종양 세포 주입 후. 얼마나 시간이 Dendra2 photoswitchable 단백질이나 다른 형광 단백질을 표현하는 세포의 주입이 사용 세포주에 따라 이후에 전달했다. 종양이 가시 괴사성하지 않아야하며, 종양의 위에 머리를 그대로 피부에 있어야합니다. 괴사성 종양과 생쥐 euthanized해야합니다.
  2. 대한 멸균 공간을 준비 살균 후드 내부 살균 헝겊 조각을 아래로 수술 - 레이. 무균 g의 한 조각을 넣어중간에 auze하고, 주변에 몇 MIWs 및 살균 악기를하다 : 우리는 작은 표준 가위, 스프링 가위, 핀셋 microdissecting, microdissecting 집게, 바늘 홀더를 사용합니다. Q - 팁, 70 % 에탄올과 후드의 모서리에 멸균 장갑 한 병 멸균 보관.
  3. 마우스 HBSS에 2.5 % avertin의 IP 주입 (20 μl / G)를 사용하여 멸균 모자 anesthetized하거나, 또는 10 μg / kg 케타민을 + 10 μg / g xylazine (승인 및 주문에 대한 애니멀 케어 연구소에 문의).
    참고 : Avertin 솔루션 준비를해야 격주, 필터 0.22 μm의 필터와 4 500 μl aliquots으로 저장 사용하여 소독 ° C (어둠 속에서).
  4. 작은 동물 면도기를 사용하여 종양이 위의 지역을 면도기로 머리카락을 제거합니다.
  5. 나이르 헤어 제거 크림 (모든 약국에서 사용할 수있는)를 사용하여 머리의 나머지 부분을 제거합니다. 에탄올 담근 Q - 도움말을 사용하여 피부를 청소합니다.
  6. 멸균 거즈로 동물을 전송하고 건조 및 감염에서 그들을 유지하는 눈 안과 연고를 적용합니다.
  7. betadine로 피부를 소독하고 70 % 에탄올로 닦아주십시오.
  8. 멸균 후드 내부 살균 수술 천으로에 동물을 전송합니다.
  9. 피부에 포셉 및 컷 ~ 2mm의 절개를 사용하여 유두 바로 중간 피부를 당겨.
  10. 해부 가위와 집게를 사용하여 피부의 근본적인 내유 지방 패드를 분리합니다. MIW의 삽입을 수용할 수있는 크기로이 분리 단계에서 피부와 구멍 스트레치.
  11. 실수로 혈관이 sugery 도중 충돌하는 경우, 생산 / 과도한되는에서 출혈을 멈추게하는 모든 혈액을 제거하는 살균 Q - 팁을 사용합니다.
  12. 장소에 MIW 기지와 봉합의 피부 위에 비 흡수성 나사를 사용하고 바늘을 절단 반대가되는 등 MIW를 삽입합니다.
  13. suturing 구멍을 기입하여 피부에 MIW를 보호하는 조직 접착제 또는 cyanoacrylate 사용합니다.
  14. TMP - SMX 항생제 믹스를 추가합니다 (Sulfamethoxazole 0.6 MG / ML, 트리 메소 프림 0.12 MG / ML) 수술 전후 3 일간 케이지 물통에.
  15. 동물 avertin의 IP 주입 후 1 4h을위한 마취 유지됩니다. 수술은 일반적으로 ~ 45 분 걸립니다 때문에, 그것은 동물이 나중에 복구할 수 있도록하는 것이 중요합니다 :
  16. 손 손난로 새장 바닥에 (37 ° C)을 (약국에서 사용할 수있는) 장소와 거즈로 커버.
  17. 그것은 위장에 돌면서 걷기 시작할 때까지 패드 위에 쓰레기야.
  18. 동물 3H 이상 의식이있다면, rehydration 위해 HBSS intraperitoneally의 0.3 ML를 삽입.
  19. 동물은 첫 번째 영상 세션이 일어나기 전에 다음 3~4일 동안 복구할 수 있습니다.

4. 이미지 박스 건설

이미지 상자가 MIW 바로 현미경 목표 위에 평면 앉아 거 아닌가. 또한 isoflurane 끊임없이 공기를 통해 온도 및 마취 제어를 용이하게합니다. 상자는 플렉시 글라스로 만들어진 플라스틱 용접을 사용하여 붙어있다. 이것은 특정 현미경 단계에 대한 장착되어 있으므로 그 아래쪽의 모양은 (그림 2 Leica SP5 현미경 단계에 장착되어 상자의 구조를 보여주는) 사용 현미경에 따라 다릅니다 수 있습니다.
cm의 상자의 크기 제가 아르 = 11.4 cm, W = 7.6 cm, H = 4.4 cm (그림 2A). 상자의 아래쪽은 Leica SP5 현미경 스테이지 내부에 적합한 빈 접시의 크기 12.7x8.4 cm, 두 슬라이딩 "문", 원형 오프닝 (양식 5.7 X 5.7 cm_each로 구성되어 D = 2.22 cm ) 닫을 때. MIW이 열기에 맞는. 사이드 조각 중 하나가 진공으로 연결 콘센트 구멍을 포함하는 동안 전면 조각은 마취 배달을위한 입구 구멍이 포함되어 있습니다.
콘덴서와 슬라이드 홀더는 이미지 상자 배치하기 전에 제거해야합니다.

5. 이미징 박스 사용

  1. isoflurane과 마취하에 동물을 놓고 눈 안과 연고를 적용합니다.
  2. 입구 구멍 (그림 2B)의 밖에서, 마취 기계에서 이미징 상자 앞에 isoflurane 배기를 연결합니다.
  3. 이미지 상자의 콘센트 구멍에 두 번째 튜브를 연결합니다. 이 튜브는 가스 필터 다음 진공에 첨부해야합니다.
  4. 상자 뚜껑을 열고 상자 문을 열고 동물, 아래쪽을 향하고 MIW 측면을 배치하고 상자에 문을 슬라이딩.
  5. 상자를 잡고 MIW 기지가 개최와 그 사이에 고정되도록 바닥 문을 조정합니다. MIW의 coverslip이 수준 아래에 몇 mm해야하는 동안 MIW 기지는 이미징 박스 도어와 같은 수준으로해야합니다. 하단 문을 상자에 병렬 문을 슬라이딩 하단 사이 MIW의 위치는 coverslip (MIW의 유리 부분)이 평평하게 거짓말을 보장 있는지 확인합니다. 이것은 적절한 초점을 보장합니다.
  6. 에있는 상자의 배치를위한 공간을 허용하는, 현미경의 목표를 낮은현미경 스테이지의 상단.
  7. 현미경 스테이지에 상자를 삽입하고, MIW의 coverslip이 객관적 위에 있도록 무대를 조정합니다.
  8. 목적을 집중하고 이미지를 시작합니다.
  9. isoflurane을 사용하는 동안 동물은 호흡 주파수의 육안 검사에 의해 모니터링해야합니다. 이것은 또는 영상 모음 (이들은 데이터 수집을 방해할 수) 중에 나타나는 호흡 유물의 빈도를 모니터링하여 시각적으로 수행할 수 있습니다. MouseOx 펄스 oximetry 시스템 (스타 생명 과학 코프)가 성공적으로 사용되었습니다. 그 방법은 데이터가 동물을 확인하는 방 안에 불을 돌려하지 않고 지속적으로 수집하실 수 있습니다.
    참고 : 각 이미지 세션 후, 동물의 복구가 거즈 또는 kimwipes의 작은 손 가열 패드를 배치하고 새장에 동물 밑에 넣어 촉진해야합니다.
    참고 : 침지 목표가 MIW을 통해 이미지를 사용하는 경우, 집중 매체 (글리세롤, 물, 기름)이 이미지 창을 청소해야합니다. MIW은 이미징하는 동안 발생했을 수있는 균열 또는 기타 손해에 대해 검사해야합니다. 이것은 여러 개의 영상 세션 동안 데이터를 수집하기 위해 중요합니다.

6. Dendra2 - 라벨 세포 Photoswitching 및 이미징

절차는 Leica SP5 공촛점 현미경에 대한 설명, 최적화하기위한 가이드로 사용해야 다른 공촛점 현미경을 사용하거나 multiphoton 이미징가 설정할 때 초점 비행기에서 레이저의 파워, 가능한 목표 및 소프트웨어 옵션은 다양하고, 따라서 프로토콜은 아래에 설명된 귀하의 현미경에 실험.

  1. 녹색 형광 필터와 접안 렌즈 (10X)를 통해 종양을 관찰함으로써, 가시 흐르는와 같은 초점 평면에서 평면 누워 주요 혈관을 찾습니다.
  2. PMT 감지 분야 및 스위치의 중앙에있는 선박 중 하나가 위치.
  3. 두 개 채널에 대한 순차적인 이미지 모음을 설정합니다. 채널 중 하나는 488nm 레이저 라인 (10 % 전력)을 사용하고, Dendra2 (505 - 540nm)의 녹색 양식에서 세포외 기질 (480 495nm) 및 방사로부터 비산를 수집합니다. 두 번째 채널은 543nm 레이저 라인 (90% 전력)을 사용하고 Dendra2의 붉은 양식 (555 - 600nm)의 방출을 수집합니다. 3D 이미지 사전 photoswitching를 수집합니다.
  4. 405nm 레이저 라인 (30 % 전력, 20-40 스캔)를 사용하여 셀 선택 인구 photoswitch 수있는 투자 수익 (ROI) 스캔 옵션을 사용하십시오. 전환을 모니터하기 위해 단백질의 붉은 양식의 방출을 수집합니다.
  5. 같은 순차 루틴 6.3에서와 같이를 사용하여, 사후 전환 3D 이미지를 수집합니다.
  6. 종양에 하나 이상의 영역을 photoswitching면, 그것은 녹색과 빨간색 두 채널 (그림 3A, B)에서 디지털 카메라를 사용하여 oculars를 통해 사진을 찍을 것이 좋습니다입니다. 이것은 이후 영상 세션 동안 방향으로 도움이 될 것입니다.
    참고 : 또한 혈관이 일시적으로 형광 dextran (캐스케이드 블루 또는 알렉사 플루어 647 두 10kDa)의 꼬리 - 정맥 주사를 사용하여 표시하실 수 있습니다. 몇 시간 주사 후 dextrans은 혈관을두고 영구적으로 macrophages 레이블을 것입니다.

대표 결과 :

그림 3C는 혈관 (없음 형광)에 상대 orthogonally 지향 사각형 photoswitched 지역 (빨간색)를 보여줍니다. 세포외 기질의 비산이 보라색 동안 비 photoswitched 세포가 녹색입니다. 이미지가 Z 축 (20-50 μm의 깊이)을 따라 사진 네 최대 강도 투사입니다.

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Acknowledgments

(; JC, JES 및 JW하는 CA100324, JvR에 U54GM064346 JES하는 CA77522, JC와 BG에 U54CA126511)이 작품은 미국 국방과 (BG 및 DK로 BC061403 BC075554로), 건강의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 현미경, 이미징 상자와 F4/80 항체에 대한 J. 폴라드 (의학의 앨버트 아인슈타인 대학)의 제조에 대한 도움 M. Rottenkolber에 대한 도움말 D. Entenberg 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS w/o Ca, Mg GIBCO, by Life Technologies 14190-144
Trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300
HBSS GIBCO, by Life Technologies 14025
DMEM media (MDA-MB-231 cells) GIBCO, by Life Technologies 11965
Isoflurane(Aerrane) Baxter Internationl Inc. # NDC 10019-773-40
SCID mouse National Cancer Institute N/A
Culture dishes BD Biosciences 353003 Custom Order
Circular coverslip 8 mm Scientific, Inc. 8CIR-1-FIS

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References

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Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window. J. Vis. Exp. (28), e1278, doi:10.3791/1278 (2009).

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