Summary
노크를 다운 유전자 표현의에 대한 바이러스 유도된 유전자 입을 (VIGS) 메서드에 대한 설명
Abstract
RNA 간섭 (RNAi)는 dsRNA 1 트리거 높은 특정 유전자 입을 현상입니다. microRNAs, 비 단백질 코딩 유전자와 짧은 간섭 RNAS (siRNAs)에서 생산이 입을 메커니즘은 RNA의 규제의 두 가지 주요 클래스를 사용합니다. 식물은 transposons을 제어와 같은 꽃 기관 형성과 잎 개발 2,3,4으로 개발 프로세스를 통해 꽉 컨트롤을 발휘하는 RNAi를 사용합니다. 식물은 또한 바이러스에 의해 감염으로부터 자신을 방어하기 위해 RNAi를 사용합니다. 따라서, 많은 바이러스는 숙주 5 그들의 성공적인 식민지를 허용하도록 입을 유전자의 진압을 발전시켜 왔습니다.
바이러스 유발 유전자 입을 (VIGS)는 공장 RNAi - 중재 항바이러스 방어 메커니즘을 활용하는 방법입니다. 수정되지 않은 바이러스에 감염된 식물의 메커니즘은 특히 바이러스 게놈에 대해 타겟팅됩니다. 그러나, 호스트 유전자에서 파생 시퀀스를 들고 바이러스 벡터와 프로세스가 추가로 해당 호스트 mRNAs에 대해 타겟팅할 수 있습니다. VIGS이 플라스미드는 티, 전체 또는 입을를 대상으로 유전자 시퀀스의 일부를지고 재조합 바이러스를 통해 제공하는 식물 병원균 Agrobacterium tumefaciens의를 사용하여 공장에서 높은 처리량 기능 유전체학에 맞게 조정될 수 있습니다. 체계적 바이러스 확산과 내생 식물 RNAi 기계는 알아서. 대상 유전자에 해당하는 dsRNAs의 길이는 21-24 세포핵의 siRNAs로 ribonuclease의 주사위 놀이를하는 사람에 의해 만들어진 후 죽습 있습니다. 이 siRNAs는 궁극적으로 목표 성적 증명서 2 타락하는 RNA 유발 입을 복합 (RISC)를 안내입니다.
다른 벡터는 VIGS에 고용되어 있고 가장 자주 사용 중 하나가 담배 텅 바이러스 (TRV)를 기반으로합니다. TRV는 bipartite 바이러스 등, 두 개의 다른 A.로 tumefaciens의 변종은 VIGS에 사용됩니다. 하나는 pTRV2, 다른 하나는 코트의 단백질과 VIGS 6,7에 사용되는 순서를 항구 동안 복제 및 운동 바이러스 기능을 인코딩 pTRV1을 수행합니다. Nicotiana benthamiana과 유전자 입을의 변종 결과 모두의 혼합물과 함께 토마토 모종의 접종. photobleaching 원인 내생 phytoene desaturase (PDS) 유전자,의 입을는 VIGS 효율을위한 컨트롤로 사용됩니다. 그것은 지적되어야하지만, 토마토에 입을는 보통 N.보다 덜 효율적이다 benthamiana. 관심 유전자의 RNA 대본 풍부한는 항상 대상 유전자를 효율적으로 다운 - 규제되었음을 보장하기 위해 측정해야합니다. N.에서 그럼에도 불구하고, heterologous 유전자 시퀀스 benthamiana는 토마토와 반대 8 해당 orthologs을 침묵하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1 부 : 식물
입을 사용 N. benthamiana 공장은 2 주위해야 ½ 주 된 어느 cotyledons하고 처음 2 시간 - 4 사실 단풍이 등장했습니다. 팔일 게시물 출현, 진정한 단풍이 아직 등장하지 않은 - 토마토 (솔라넘 lycopersicum) 식물 7을 사용하고 있습니다.
2 부 : VIGS
1 일
- 각 실험, pTRV1을 품고 Agrobacterium tumefaciens의, pTRV2, pTRV2 - 자료실 및 pTRV2 - 호스트 대상 유전자 50 μg / kanamycin의 ML 100 μg / rifampicin의 ML과 보충 LB 한천 플레이트에 재배하고 있습니다. rifampicin이 Agrobacterium 줘서 않지만 kanamycin은 pTRV 플라스미드를위한 선택합니다. 2 일 30 ° C에서 번호판을 품어.
PDS의 입을 것은 photobleach 수있는 식물을 일으킬 것이며, 입을 효율성 컨트롤로 사용됩니다. 또한, downregulated하는 유전자는 pTRV2 벡터로 복제해야합니다. 이 복제를 용이하게 수있는 게이트웨이 호환 pTRV2 벡터이며 리우 외 의해 설명되어 있습니다. (2002).
3 일
- 변종 각 위에서 언급한 항생제와 LB 3 ML 액체 문화 - 2의 예방. 18시간 200 RPM - 16 30 ° C에서 흔들어으로 품어
DAY 4
- kanamycin, rifampicin 200 μm의의 acetosyringone (표 1, 2, 3) 보조 액체 유도 미디어 (IM) 메신저 문화에 가장 큰 문화의 25 희석 : 1의 예방. acetosyringone은 IM이 환경에게 호스트 apoplast이 병원체 조우를 모방하면서 공장 구에 T - DNA 전송에 필요한 Agrobacterium의 비르 유전자의 유도로 사용됩니다. 20 30 ° C에서 흔들어에 의해 부화 - 24 시간 200 RPM을
5 일
- 3000 X G. 10 분 centrifugating하여 세포를 수확 원래 문화 10 MM MgCl 2, 10 MM MES 산도 5.5했던 동일한 볼륨에 Resuspend. 전지는 부드럽게 그들을 resuspend하는 vortexed 수 있습니다.
- 3000 X G. 10 분 다시 전지를 Centrifugue 10 MM MgCl2, 10 MM MES 산도 5.5 원래의 문화의 절반 볼륨 Resuspend.
- 각 세균성 문화 OD 0.3 600과 세균 현탁액을 준비합니다. pTRV1 문화 400 μm의의 최종 농도 acetosyringone 추가합니다.
- pTRV1와 1-1 비율 pTRV2 (또는 관심있는 유전자를 포함하는 pTRV2)이있는 문화를 섞는다. 또한이 pTRV2 - PDS 컨트롤을 포함합니다. 최종 acetosyringone 농도 지금 200 μm의하고 각 문화가 0.15의 OD 600에서입니다 점에 유의하시기 바랍니다.
- 침묵하는 유전자와 실험의 날짜와 침투 수 묘목을 라벨.
- 바늘로 침투하는 각각의 나뭇잎에 구멍을 포크. 묘목에 박테리아 현탁액에 침투 1 ML 불필요한 주사기를 사용합니다. 토마토의 경우, 두 cotyledons 침투 N.위한 동안 benthamiana, 가장 큰이 진정한 나뭇잎을 침투. 각 세균 혼합물의 다섯 ML 15 N. 침투 정도로해야합니다 benthamiana 25 토마토 모종. infiltrations 사이 접종 후 다음날까지 식물에 물을하지 않음으로써 장갑을 변경하여 교차 오염을 피한다.
- 식물은 20 유지하고있다 - 22 ° C, 16 시간 하루 길이들은 assays에 사용할 수 있습니다 전에 적어도 3 ½ 주에 대한 RH 50 % 성장 챔버 인치
파트 3 : 대표 결과
그림 1은 N.있는 대표 실험을 보여줍니다 benthamiana, 토마토 식물 자료실에 대해 침묵. 식물은 carotenoids의 저하 금액과 식물의 관찰 특성 photobleaching 표현형을 보여줍니다. PDS - 침묵 제어 식물 들어, photobleaching 시작 마자 1로 볼 수 ½ 주 침투 후.
그림 1. PDS 제어 유전자의 입을은 N. benthamiana (A), 토마토 (B) 공장에서 photobleaching됩니다. 사진 3 ½ 주 입을 후에 찍은.
표 1. 유도 매체 (IM)의 작성.
| 400 ML | 소주 H 2 O |
| 4.88 g | MES (2 - (4 morpholino) 에탄 술폰산) |
| 2.5 g | 포도당 |
| 0.12 g | 아니 2 PO 4 |
DH 2 O와 475 ML의 최종 볼륨을 지참하고 5.6으로 산도를 조정합니다. 압력솥. 매체 식었 후, 20X AB 소금의 25 ML를 추가합니다.
표 2. AB 소금의 작성.
| 20g | NH 4 Club 호텔 |
| 6g | MgSO 4 명이 7H 2 O |
| 3g | KCl |
| 0.2 g | CaCl 2 |
| 0.05 g | FeSO 4 명이 7H 2 O |
증류수 1 리터의 최종 볼륨을 가져와. 압력솥. AB의 소금이 오렌지색 분말로 침전하지 않을 수도 있습니다. 그들의 사용하기 전에 소용돌이에 의해 그것들을 잘 섞는다.
표 3. 200 MM의 Acetosyringone의 작성. acetosyringone 그것이 사용됩니다 하루를 준비한다고 유의하시기 바랍니다.
| 19.6 MG | Acetosyringone (3 ', 5' - Dimethoxy - 4' - hydroxyacetophenone) |
| 500 μL | DMSO (디메틸 sulfoxide) |
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Discussion
바이러스 유발 유전자 입을은 빠른 반대로 유전자 화면을 허용하는 방법입니다. 그것은 T - DNA 또는 Arabidopsis와 옥수수 같은 특정 식물에서만 사용할 수 있습니다 transposon의 중재 유전자 노크 아웃의 생성을 방지합니다. 또한 공장 변환의 시간이 소요되는 과정을 circumvents하고 그들이 충분한 상동 10 또는 다른 호스트 대상 시퀀스가 입을 벡터 6, 11 창출 배열되어있다는 제공 동시에 여러 유전자의 타겟팅을 수 있습니다.
그러나, 입을는 절대 100 %의 바이러스가 완성하고 결과를 해석하면 따라서주의가 이동한다이다. 부정적인 결과는 단순히 잔여 단백질 농도가 명백한 phenotypic 결과없이 기능을 수행하는 데 충분한 것을 나타낼 수 있습니다. 는 각 유전자에 대해 입을 구조를 생성하기 위해 적어도 두 개의 서로 다른 mRNA 영역을 사용하는 것이 좋습니다 항상하므로 또한, 일부 구조가 다른 것보다 더 잘 입을 수 있습니다. 또한,이 전이 입을 원인이 될 수 있습니다 보조 siRNAs, 당신의 입을 구조 또는 경우 유전자의 충분한 상동이있다면 외부 대상 입을 가능성은 항상 12 생산됩니다. 이것은 유전자 가족에 특히 진실 보유하고 있습니다. 그것은 RT - PCR이나 노던 얼룩 분석을 통해, 목표 및 오프 대상 유전자의 입을 효율성을 계량하는 것이 가장 중요합니다. RT - PCR이 VIGS 효율성을 추정하는 방법으로 선택한 경우, primers 중 하나는 바이러스에 의해 생산되는 성적표도 증폭하고 그 결과 진정의 dowregulation을 반영되지 않도록 입을 대한 타겟 지역 밖에있는 유전자에 어닐링해야 특정 내생 유전자.
VIGS 효율은 항상 N.으로 크다 이 토마토에보다 benthamiana. 토마토 모종을 입을 때 그러므로,주의 이동합니다. 토마토에서는, 그것은 바로 식물 발달 단계를 선택하고 바이러스 확산을위한 적절한 환경 조건을 유지하기 위해 중요합니다. 또한, 유전자 사본의 풍부는 연구에 따라 각 식물에 대해 수행되어야합니다. 또한, 보통 토마토 VIGS에서 A. tumefaciens 스트레인은 N.의 GV3101 동안이다 benthamiana GV3101 또는 GV2260 중 하나는 6,13를 사용하고 있습니다. 그것은 다른 동물에서 heterologous 순서를 채용 유전자, 둘 사이에 충분한 상동가 제공을 침묵이 가능합니다. 또한 pTRV2 - 대상 유전자 벡터를 구축하면, 삽입 길이 200-1000 BP의 범위에 있어야 그들은 homopolymeric 지역 (예 : 폴리 꼬리) 14를 포함해서는 안됩니다.
관심의 유전자 pTRV2를 들고 문화가 PDS으로 오염되어있다면, 가끔 photobleaching이 관찰되지 않습니다. 대신, 식물 짧은 희망합니다. 따라서, 그것은 실험 기간 동안 교차 오염의 소스를 최소화하기 위해 중요합니다 어떤 잠재적인 편견 결과를 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 원고에 대한 그녀의 귀중한 통찰력에 대한 박사 패트리샤 Manosalva 감사합니다. 기금은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 식물 게놈 프로그램, 보너스 번호 DBI - 0605059에 의해 제공되었다.
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