فيروس من صنع جين إسكات (VIGS) في نيكوتيانا benthamiana والطماطم

Summary

وصف لطريقة التي يسببها الفيروس الجين (VIGS) لإسكات أسفل طرق التعبير الجيني في

Abstract

تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هي محددة للغاية إسكات الجينات الظاهرة سببها الرنا المزدوج الجديلة ^1. هذه الآلية إسكات يستخدم اثنين من الفئات الكبرى من المنظمين RNA : microRNAs ، والتي يتم إنتاجها من البروتين غير ترميز الجينات وقصيرة الرناوات التدخل (siRNAs). استخدام النباتات لمكافحة رني ترانسبوزونات وممارسة رقابة مشددة على عمليات التنمية مثل تشكيل هيئة زهرة نبات ^2،3،4 والتنمية. النباتات أيضا استخدام رني للدفاع عن أنفسهم ضد عدوى الفيروسات. وبالتالي ، تطورت العديد من الفيروسات المكثفات من إسكات جينات للسماح بنجاح استعمارها المضيفة ^5.

فيروس من صنع إسكات الجينات (VIGS) هو الأسلوب الذي يستفيد من رني بوساطة محطة الآلية الدفاعية المضادة للفيروسات. في النباتات المصابة بفيروسات معدلة وتستهدف على وجه التحديد آلية ضد الجينوم الفيروسي. ومع ذلك ، مع ناقلات تحمل الفيروس تسلسل الجينات المستمدة من المضيف ، ويمكن بالإضافة إلى ذلك استهدفت عملية ضد mRNAs المضيف المطابق. وقد تم تكييفها لVIGS عالية الإنتاجية الجينوميات الوظيفية في النباتات باستخدام محطة الممرض المورمة الأجرعية لتسليم عبر تي في البلازميد ، وهو فيروس المؤتلف تحمل كامل أو جزء من تسلسل الجينات المستهدفة لإسكات. النظامية انتشار الفيروس وآلات مصنع الذاتية رني رعاية بقية. ويتم إنتاج dsRNAs المقابلة لهدف والجينات المشقوق ثم بواسطة المقامر ريبونوكلياز في siRNAs من 21-24 النيوكليوتيدات في الطول. هذه النهاية siRNAs دليل الحمض النووي الريبي التي يسببها إسكات المعقدة (RISC) أن تتحلل نص الهدف ^2.

وقد استخدمت ناقلات مختلفة في VIGS ويستند واحدة من أكثر استخداما على التبغ حشرجة فيروس (TRV). TRV هو فيروس الثنائية ، وكما ألف اثنين من الممثلين ، ومختلف تستخدم سلالات المورمة لVIGS. واحد يحمل pTRV1 ، الذي يشفر وظائف النسخ والحركة الفيروسية في حين أن الآخر ، pTRV2 والموانئ معطف البروتين وتسلسل المستخدمة لVIGS ^6،7. تلقيح benthamiana نيكوتيانا وشتلات الطماطم مع خليط من سلالات النتائج سواء في إسكات الجينات. يستخدم إسكات الجين phytoene الذاتية (PDS) desaturase ، والذي يسبب photobleaching ، بوصفها لمراقبة كفاءة VIGS. وتجدر الإشارة إلى أنه ، مع ذلك ، أن إسكات في الطماطم هي عادة أقل كفاءة مما كان عليه في N. benthamiana. وينبغي دائما RNA فرة نسخة من هذا الجين من الفائدة يمكن قياسها للتأكد من أن الجينات المستهدفة أسفل تم بكفاءة التنظيم. ومع ذلك ، تسلسل الجينات غيري من N. يمكن أن تستخدم لإسكات benthamiana orthologs كل منهما في الطماطم ، والعكس بالعكس ^8.

Protocol

الجزء 1 : المواد النباتية

يجب ن النباتات المستخدمة لإسكات benthamiana يكون حوالي 2 ½ أسابيع من العمر والذي هو وقت النبتات والأولى 2 -- 4 أوراق حقيقية ظهرت. وتستخدم الطماطم (مغد lycopersicum) مصانع 7-8 ظهور آخر أيام ، عندما يترك الحقيقية لم تظهر بعد.

الجزء 2 : VIGS

DAY 1

1. لكل تجربة ، وتزرع المورمة الأجرعية بايواء pTRV1 ، pTRV2 ، pTRV2 - PDS وpTRV2 في استضافة الجينات المستهدفة على لوحات أجار LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل من الكاناميسين و 100 ميكروغرام / مل من الريفامبيسين. والكاناميسين يختار لبلازميد pTRV في حين أن ريفامبيسين يفعل ذلك لالأجرعية. احتضان لوحة على 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
   وإسكات PDS تسبب النباتات لphotobleach ويستخدم كعنصر تحكم الكفاءة إسكات. أيضا ، لا بد من استنساخ الجينات لتكون downregulated الى ناقلات pTRV2. هناك عبارة متوافق pTRV2 ناقلات والتي قد تسهل الاستنساخ والتي وصفها ليو وآخرون. (2002).

اليوم 3

1. تطعيم (أ) 2 -- 3 مل ثقافة السائل LB مع المضادات الحيوية المذكورة أعلاه للحصول على كل من السلالات. احتضان التي تهتز عند 30 درجة مئوية لمدة 16 -- 18 ساعة ، ودورة في الدقيقة 200

اليوم 4

1. تطعيم (أ) 1 : 25 التخفيف من الثقافة الأولية إلى وسائل الإعلام التعريفي السائل الثانوي (IM) المراسلة الفورية مع ثقافة الكانامايسين ، ريفامبيسين و 200 ميكرومتر acetosyringone (الجداول 1 و 2 و 3). يستخدم بمثابة محفز acetosyringone من الجينات VIR من الأجرعية التي مطلوبة من أجل T - DNA نقل الى المحطة في حين أن ⁹ IM يحاكي البيئة واجه هذا العامل الممرض في apoplast المضيف. احتضان التي تهتز عند 30 درجة مئوية لمدة 20 -- 24 ساعة ، ودورة في الدقيقة 200

يوم 5

1. حصاد الخلايا centrifugating لمدة 10 دقائق في 3000 س غ. Resuspend في حجم نفسه إلى أن الثقافة الأصيلة وكان مع 10 ملي MgCl _{2 و} 10 ملي MES الرقم الهيدروجيني 5.5. قد تكون الخلايا vortexed برفق لresuspend لهم.
2. Centrifugue الخلايا مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 3000 س غ. Resuspend في حجم النصف من الثقافة الأصلية ب 10 ملي MgCl2 ، 10 ملي MES الرقم الهيدروجيني 5.5.
3. إعداد تعليق البكتيرية مع OD ₆₀₀ من 0.3 لكل ثقافة البكتيرية. إضافة إلى تركيز acetosyringone النهائي من 400 ميكرومتر لثقافة pTRV1.
4. مزج الثقافات التي تحتوي على pTRV1 وpTRV2 (أو التي تحتوي على الجين pTRV2 المصالح) في نسبة 1 إلى 1. كما تشمل الرقابة pTRV2 - PDS. يرجى ملاحظة أن تركيز acetosyringone النهائي هو الآن 200 ميكرومتر وأن لكل ثقافة وصلت الى ₆₀₀ من OD 0.15.
5. تسمية الشتلات أن تسللت مع الجينات لإسكاته ، وتاريخ التجربة.
6. كزة حفرة في كل ورقة لتكون تسللت مع إبرة. استخدام حقنة 1 مل لا داعي لها للتسلل الى تعليق البكتيرية في الشتلات. الطماطم ، سواء النبتات التسلل بينما لN. benthamiana ، التسلل أكبر اثنين من يترك صحيحا. وينبغي أن مل من كل خمسة خليط البكتيرية تكون كافية لاختراق 15 N. وشتلات الطماطم benthamiana 25. تجنب انتقال التلوث عن طريق تغيير القفازات بين عمليات التسلل وعدم سقي النباتات حتى اليوم التالي بعد التلقيح.
7. وتحفظ النباتات في 20-22 درجة مئوية في غرفة النمو مع طول اليوم 16 ساعة و 50 ٪ RH لأسابيع ونصف على الأقل قبل 3 يمكن استخدامها لفحوصات.

الجزء 3 : نتائج الممثل

الشكل 1 يوضح تجربة مع ممثل N. benthamiana نباتات الطماطم وأسكت عن نظام التوزيع العام. النباتات تظهر سمات النمط الظاهري photobleaching التي لوحظت في النباتات مع تناقص كميات من الكاروتينات. لإسكات - PDS محطات مراقبة ، ويبدأ photobleaching أن ينظر إليها في أقرب وقت بعد اسابيع من 1 ½ التسلل.

الشكل 1. إسكات الجينات السيطرة PDS أسباب photobleaching في benthamiana N. (A) ونباتات الطماطم (B). وقد اتخذت صورا أسابيع ½ 3 بعد إسكات.

الجدول 1. إعداد متوسطة التعريفي (IM).

400 مل	المقطر H 2 O
4.88 ز	MES (2 -- 4 (morpholino) - الإيثان حمض السلفونيك)
2.5 غرام	جلوكوز
0.12 ز	ناه 2 ص 4

جلب إلى الحجم النهائي من 475 مل مع DH ₂ O وضبط درجة الحموضة إلى 5.6. الأوتوكلاف. بعد تبريده والمتوسطة ، إضافة 25 مل من الأملاح AB 20X.

الجدول 2. تحضير الأملاح AB.

20 غراما	NH 4 الكلورين
6 ز	MgSO 4 · 7H 2 O
3 ز	بوكل
0.2 غرام	CaCl 2
0.05 غ	FeSO 4 · 7H 2 O

جلب إلى الحجم النهائي 1 لتر بالماء المقطر. الأوتوكلاف. أن تدرك أن أملاح تترسب AB بوصفه مسحوق البرتقال. مزيج جيد من قبل منهم فقط دوامات قبل استخدامها.

الجدول 3. إعداد Acetosyringone 200 ملم. يرجى ملاحظة أنه ينبغي إعداد acetosyringone اليوم سيتم استخدامها.

19.6 ملغ	Acetosyringone (3 '، 5' - Dimethoxy - 4' - hydroxyacetophenone)
500 ميكرولتر	DMSO (سلفوكسيد ثنائي ميثيل)

Discussion

فيروس من صنع إسكات الجين هو الأسلوب الذي يسمح السريع شاشات الجينية العكسية. انها تتجنب توليد T - DNA أو الجينات بوساطة ينقول تدق الرافضة ، والتي لا تتوفر إلا في بعض النباتات مثل الذرة وArabidopsis. انها تلتف أيضا عملية تستغرق وقتا طويلا لتحويل النباتات ويسمح للاستهداف جينات متعددة في الوقت نفسه ، شريطة أن يكون لديهم ما يكفي من التماثل ¹⁰ أو أن يتم ترتيب تسلسل هدف المضيف مختلفة جنبا إلى جنب في إسكات ناقلات ^{6 و 11.}

ومع ذلك ، لا يتم اسكات 100 ٪ كفاءة ، وبالتالي ، يجب توخي الحذر عند تفسير النتائج. قد تكون نتيجة سلبية تشير ببساطة أن تركيز البروتين المتبقية كانت كافية لتنفيذ مهمتها دون عواقب المظهري واضحة. أيضا ، بعض ثوابت هي أفضل من غيرها في إسكات ذلك فمن المستحسن دائما لاستخدام اثنين على الأقل من مناطق مختلفة مرنا لإنشاء بنيات لكل إسكات الجينات. وعلاوة على ذلك ، هناك دائما إمكانية خارج الهدف إسكات إذا كان هناك ما يكفي من التماثل مع الجين بناء إسكات أو إذا siRNAs الثانوية ، مما قد يؤدي إسكات متعدية ، وتنتج ^12. هذا ينطبق خصوصا للعائلات الجينات. ولذلك فمن الأهمية بمكان لتحديد كفاءة إسكات الجينات التي تستهدفها ، وبعيدا عن الهدف ، إما بواسطة RT - PCR أو تحليلات طخة الشمالية. إذا ما تم اختيار RT - PCR كطريقة لتقدير كفاءة VIGS ، ينبغي للمرء من الاشعال يصلب على الجينات خارج المنطقة المستهدفة لإسكات بحيث لا يتم محضر التي تنتجها الفيروس أيضا وتضخيم النتائج تعكس حقا من dowregulation جينات معينة الذاتية.

VIGS الكفاءة هي دائما أكبر في N. benthamiana مما هو عليه في الطماطم. ولذلك ، يجب اتخاذ الحذر عند إسكات شتلات الطماطم. في الطماطم ، فمن الأهمية بمكان اختيار النباتات الحق المرحلة التنموية والحفاظ على الظروف البيئية المناسبة لانتشار الفيروس. أيضا ، يجب إجراء نسخة الجين وفرة لكل محطة قيد الدراسة. بالإضافة إلى ذلك ، عادة في VIGS الطماطم ، وألف المورمة السلالة GV3101 بينما في N. وتستخدم إما benthamiana GV3101 أو GV2260 ^6،13. فمن الممكن لإسكات الجين توظيف تسلسل غيري من نوع آخر ، شريطة أن يكون هناك ما يكفي من التماثل بين البلدين. أيضا ، عند بناء ناقلات الجينات pTRV2 المستهدفة ، وينبغي أن يكون في أطوال إدراج مجموعة من 2-100 غليان ، وينبغي ألا تشمل مناطق homopolymeric (مثل بولي وذيول) ^14.

إذا أصبحت ملوثة الثقافات تحمل pTRV2 مع الجينات في المصالح مع نظام التوزيع العام ، وسوف تكون في بعض الأحيان يلاحظ أي photobleaching. بدلا من ذلك ، فإن المصانع لا أقصر قامة. لذا ، من الأهمية بمكان للحد من أي مصدر من مصادر التلوث عبر خلال التجربة التي يمكن أن يحتمل التحيز النتائج.