Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

Summary

תיאור וירוס-Induced שיטה להשתקת (VIGS) הגן לדפוק למטה של ​​ביטוי גנים

Abstract

התערבות RNA (RNAi) היא מאוד ספציפיות גנים והשתקת תופעה מופעלות על ידי dsRNA ^1. מנגנון ההשתקה משתמשת בשני סוגים עיקריים של הרגולטורים RNA: מיקרו RNA, שהן המופק ללא חלבון גנים קידוד RNAs התערבות קצר (siRNAs). צמחים משתמשים RNAi לשלוט transposons ולהפעיל פיקוח הדוק על תהליכים התפתחותיים כגון היווצרות איברים פרח ופיתוח עלה ^2,3,4. צמחים גם להשתמש RNAi להגן על עצמם מפני זיהום על ידי וירוסים. כתוצאה מכך, וירוסים רבים התפתחו מדכאי השתקה של הגן על מנת לאפשר התיישבות מוצלח שלהם של המארח שלהם ^5.

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) היא שיטה שמנצלת מנגנון המפעל RNAi בתיווך הגנה אנטי. במפעלי נגוע וירוסים ללא שינוי מנגנון מיועד במיוחד נגד הגנום הויראלי. עם זאת, עם וקטורים וירוס נושאת רצפי גנים שמקורם המארח, תהליך זה יכול להיות ממוקד ובנוסף נגד mRNAs המארח המתאים. VIGS הותאם תפוקה גבוהה גנומיקה פונקציונלית בצמחים באמצעות הצמח tumefaciens הפתוגן Agrobacterium לספק, באמצעות פלסמיד Ti שלה, וירוס רקומביננטי הנושא את כולו או חלק מרצף הגן ממוקד עבור השתקה. התפשטות הנגיף מערכתית במפעל אנדוגני RNAi מכונות לדאוג לשאר. dsRNAs המתאים הגן היעד מיוצרים ביקע מכן על ידי דייסר ribonuclease לתוך siRNAs של 21-24 נוקלאוטידים אורך. SiRNAs אלה בסופו של דבר המדריך RNA-Induced השתקה מורכבות (RISC) לבזות את התמליל היעד ^2.

וקטורים שונים כבר המועסקים VIGS ואחד הנפוצים ביותר מבוסס על טבק רעשן וירוס (TRV). TRV הוא וירוס bipartite, וכפי א, כגון שונה two זנים tumefaciens משמשים VIGS. אחת נושאת pTRV1, אשר מקודד את השכפול ואת התנועה פונקציות ויראלי בעוד אחרים, pTRV2, נמלים החלבון המעיל ואת הרצף המשמש VIGS ^6,7. הרכבה של ניקוטיאנה benthamiana ושתילי העגבניות בתערובת של שני זנים תוצאות ב להשתקת גנים. השתקת הגן אנדוגני phytoene (PDS) desaturase, הגורמת photobleaching, משמש לשלוט ליעילות VIGS. יצוין, עם זאת, ההשתקה של העגבניות הוא בדרך כלל פחות יעיל מאשר נ benthamiana. שפע תעתיק הרנ"א של הגן של עניין תמיד צריך להימדד על מנת להבטיח כי הגן היעד כבר ביעילות למטה מוסדר. עם זאת, הגן רצפים Heterologous מ נ benthamiana ניתן להשתמש כדי להשתיק orthologs שלהם ברוטב עגבניות ולהיפך ^8.

Protocol

חלק 1: חומר הצמח

נ 'מפעלי benthamiana משמש להשתקת צריך להיות סביב ½ 2 שבועות וזה הזמן שבו cotyledons ו 2 הראשון - 4 עלים אמיתיים צמחו. (Solanum lycopersicum) צמחי עגבניות משמשים 7-8 ימים שלאחר הופעתה, כאשר העלים נכון עדיין לא הופיע.

חלק 2: VIGS

יום 1

1. עבור כל ניסוי, tumefaciens Agrobacterium מחסה pTRV1, pTRV2, pTRV2-PDS ו-pTRV2 מארח הגן יעד גדלים על צלחות אגר LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל של kanamycin ו -100 מיקרוגרם / מ"ל של ריפמפיצין. Kanamycin בוחר את הפלסמיד pTRV בעוד ריפמפיצין עושה זאת עבור Agrobacterium. דגירה את הצלחת על 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
   השתקת של PDS תגרום לצמחים photobleach והוא משמש כביקורת יעילות ההשתקה. כמו כן, הגנים להיות downregulated חייב להיות משובטים לתוך וקטור pTRV2. יש Gateway תואם pTRV2 וקטור אשר עשוי להקל על שיבוט מתואר על ידי Liu et al. (2002).

יום 3

1. לחסן 2-3 התרבות מ"ל נוזל של LB עם אנטיביוטיקה הנ"ל עבור כל הזנים. לדגור על ידי רועדת על 30 מעלות צלזיוס למשך 16-18 שעות, 200 סל"ד

יום 4

1. לחסן 1: 25 דילול של התרבות ראשוני לתוך מדיה משני אינדוקציה נוזלי (IM) הודעות מיידיות עם תרבות kanamycin, ריפמפיצין ו acetosyringone 200 מיקרומטר (לוחות 1, 2 ו -3). Acetosyringone משמש inducer הגנים vir של Agrobacterium אשר נדרשים להעברת T-DNA לתוך המפעל תוך ⁹ IM מחקה את הסביבה הזאת פוגש פתוגן ב apoplast המארח. לדגור על ידי רועדת על 30 מעלות צלזיוס במשך 20 - 24 שעות ו 200 סל"ד

יום 5

1. קציר התאים על ידי centrifugating במשך 10 דקות ב 3000 x ז Resuspend בהיקף זהה את התרבות המקורית היה עם 10 מ"מ MgCl _2, 10 mM MES-pH 5.5. תאים עשויים להיות vortexed בעדינות resuspend אותם.
2. Centrifugue התאים שוב למשך 10 דקות ב 3000 x ז Resuspend בהיקף חצי התרבות המקורית עם 10 מ"מ MgCl2, 10 mM MES-pH 5.5.
3. הכן ההשעיה חיידקי עם OD ₆₀₀ של 0.3 עבור כל תרבות חיידקי. הוסף acetosyringone לריכוז סופי של 400 מיקרומטר לתרבות pTRV1.
4. מערבבים את התרבויות המכיל את pTRV1 ואת pTRV2 (או pTRV2 המכיל את הגן ריבית) בשיעור 1-1. כמו כן כוללים שליטה pTRV2-PDS. יש לציין כי ריכוז acetosyringone הסופית היא כעת 200 מיקרומטר וכי כל תרבות עומדת OD ₆₀₀ של 0.15.
5. לייבל את השתילים להיות שחדר עם הגן לשתוק ואת התאריך של הניסוי.
6. נקבו חור לתוך כל עלה להיות חדרו עם מחט. השתמש במזרק מיותר 1 מ"ל לחדור ההשעיה חיידקים לתוך שתילים. עבור עגבניות, לחדור גם cotyledons ואילו נ benthamiana, לחדור הגדולים שני עלים נכון. חמש מ"ל של תערובת כל חיידקי צריך להיות מספיק כדי לחדור 15 נ benthamiana ו 25 שתילי עגבניות. הימנע צולבות זיהום על ידי שינוי כפפות בין חדירות ועל ידי לא להשקות את הצמחים עד למחרת, לאחר חיסון.
7. הצמחים נשמרים 20-22 מעלות צלזיוס בתא הגידול באורך יום 16 שעות ו 50% לחות יחסית במשך לפחות 3 שבועות וחצי לפני שהם עשויים לשמש מבחני.

חלק 3: תוצאות נציג

איור 1 מציג ניסוי עם נציג נ benthamiana וצמחים עגבניות השתיק עבור PDS. צמחים להראות את הפנוטיפ photobleaching מאפיין שנצפתה צמחים עם כמות מצומצמת של קרוטנואידים. עבור PDS-השתיק צמחים שליטה, photobleaching מתחיל להיראות ברגע ½ 1 שבועות לאחר חדירה.

באיור 1. השתקת הגן לשלוט PDS גורם photobleaching ב נ benthamiana (א) ו עגבניות (ב) צמחים. התמונות צולמו 3 שבועות וחצי לאחר השתקה.

טבלה 1. הכנת בינוני אינדוקציה (IM).

400 מ"ל	מזוקקים H 2 O
4.88 גר '	MES (2 - (4 morpholino), אתאן חומצה sulfonic)
2.5 גרם	גלוקוז
0.12 גר '	לאא 2 PO 4

מביאים נפח סופי של 475 מ"ל עם DH ₂ O ו להתאים את pH עד 5.6. דוד לחץ. לאחר המדיום מתקרר, להוסיף 25 מ"ל של 20X מלחי AB.

טבלה 2. הכנת מלחים AB.

20 גרם	NH 4 Cl
6 גרם	MgSO 4 ° 7H 2 O
3 גרם	KCl
0.2 גרם	CaCl 2
0.05 גר '	FeSO 4 ° 7H 2 O

מביאים נפח סופי של 1 ליטר עם מים מזוקקים. החיטוי. שים לב כי מלחי א.ב. לזרז כאבקה תפוז. רק לערבב אותם היטב על ידי מתערבל לפני השימוש בהם.

לוח 3. הכנת Acetosyringone 200 מ"מ. שים לב acetosyringone צריכים להיות מוכנים ביום זה ישמש.

19.6 מ"ג	Acetosyringone (3 ', 5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone)
500 μL	DMSO (sulfoxide דימתיל)

Discussion

Virus-Induced השתקת הגן היא שיטה המאפשרת מהירה מסכי גנטית הפוכה. זה ימנע את הדור של T-DNA או גן transposon בתיווך דפיקה-outs, אשר זמינים רק בצמחים מסוימים כמו ארבידופסיס תירס. זה גם עוקף את התהליך לארוך זמן רב של טרנספורמציה הצמח מאפשר מיקוד של גנים מרובים בו זמנית, בתנאי שיש להם מספיק הומולוגיה ¹⁰ או שונה יעד רצפים מארח מסודרים במקביל להשתיק את וקטור ^{6, 11.}

עם זאת, השתקה אף פעם לא 100% יעיל, ועל כן יש להקפיד כאשר פירוש התוצאות. תוצאה שלילית יכולה פשוט עולה כי ריכוז החלבון שיורי היה די כדי לבצע את תפקידו ללא השלכות פנוטיפי ברור. כמו כן, בונה כמה טובים יותר מאחרים השתקה כך זה תמיד רצוי להשתמש לפחות בשני אזורים mRNA שונים כדי ליצור את ההשתקה בונה עבור כל גן. יתר על כן, תמיד יש את האפשרות של השתקה מחוץ היעד אם יש מספיק הומולוגיה של הגן עם לבנות ההשתקה שלך, או אם siRNAs משני, אשר עלול לגרום השתקה יוצא, מיוצרים ^12. הדבר נכון במיוחד עבור משפחות גנים. לכן חשיבות עליונה לכמת את היעילות והשתקת היעד שלך מחוץ היעד הגנים, או על ידי RT-PCR או ניתוחים צפון כתם. אם RT-PCR נבחר כשיטה להערכת יעילות VIGS, אחד primers צריך לחשל את הגן מחוץ לאזור ממוקד עבור השתקה כך תעתיק להיות מיוצר על ידי הנגיף אינו מוגבר גם והתוצאות באמת משקפים את dowregulation של גן אנדוגני בפרט.

יעילות VIGS תמיד יותר נ benthamiana מאשר ב עגבניות. לכן, יש לנקוט זהירות כאשר ההשתקה שתילי עגבניות. ב עגבניות, חשוב לבחור את הצמח הנכון בשלב התפתחותי ולשמור על תנאים סביבתיים ראוי להפיץ ויראלית. כמו כן, תמליל שפע הגן יש לבצע עבור כל צמח תחת מחקר. בנוסף, בדרך כלל VIGS עגבניות, א ' זן tumefaciens הוא GV3101 בעוד נ benthamiana או GV3101 GV2260 או משמשים ^6,13. אפשר להשתיק גן העסקת רצף Heterologous של מין אחר, בתנאי שיש מספיק הומולוגיה בין השניים. כמו כן, בעת בניית וקטור pTRV2-היעד גן, באורכים להכניס צריך להיות בטווח של 200-1000 bp והם לא לכלול אזורים homopolymeric (למשל פולי זנבות) ^14.

אם תרבויות נושאת pTRV2 עם הגנים של עניין להזדהם עם PDS, לפעמים photobleaching לא יקויימו. במקום זאת, צמחים יהיה בעל שיעור קומה קצרה. לכן, זה קריטי כדי למזער את מקורות זיהום לחצות במהלך הניסוי אשר עלול הטיית התוצאות.