Summary
Beschreibung eines Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-Methode für knock-down der Genexpression in
Abstract
RNA-Interferenz (RNAi) ist ein hoch spezifisches Gen-Silencing Phänomen durch dsRNA 1 ausgelöst. Das Schweigen Mechanismus nutzt zwei große Klassen von RNA Regulatoren: microRNAs, die aus Nicht-Protein-kodierende Gene und short interfering RNAs (siRNAs) hergestellt werden. Pflanzen nutzen RNAi auf Transposons zu kontrollieren und eine strenge Kontrolle über Entwicklungsprozesse wie Blume Organbildung und Blattentwicklung 2,3,4 auszuüben. Auch Pflanzen nutzen RNAi, um sich vor Ansteckung zu schützen, die durch Viren. Folglich haben viele Viren Suppressoren von Gen-Silencing, um ihre erfolgreiche Kolonisation des Aufnahmelandes 5 erlauben entwickelt.
Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS) ist eine Methode, die die Vorteile der Anlage RNAi-vermittelten antiviralen Abwehrmechanismus. In Anlagen mit unveränderten Viren infiziert ist der Mechanismus der spezifisch gegen das virale Genom gezielt. Doch mit Virus-Vektoren tragen Sequenzen aus Wirtsgenen abgeleitet, kann das Verfahren zusätzlich mit den entsprechenden Host-mRNAs ausgerichtet sein. VIGS für High-Throughput-funktionelle Genomik in Pflanzen wurde mit Hilfe des Pflanzenpathogen Agrobacterium tumefaciens zu liefern angepasst, über dessen Ti-Plasmid, ein rekombinantes Virus, das die gesamte oder einen Teil der Gensequenz zum Schweigen ausgerichtet. Systemische Virus zu verbreiten und die endogenen RNAi-Maschinerie kümmern uns um den Rest. dsRNAs entsprechend dem Ziel-Gen hergestellt und dann gespalten durch die Ribonuklease Dicer zu siRNAs von 21 bis 24 Nukleotiden Länge. Diese siRNAs letztlich führen den RNA-induced silencing complex (RISC), um die Ziel-Transkript 2 degradieren.
Verschiedene Vektoren wurden in VIGS eingesetzt und einer der am häufigsten verwendet wird, auf Tabak Rassel-Virus (TRV) basiert. TRV ist eine zweiteilige Antivirus und als solcher zwei verschiedene A. tumefaciens-Stämme sind für VIGS verwendet. Einer trägt pTRV1, die die Replikation und Bewegung viralen Funktionen kodiert, während das andere, pTRV2, birgt das Hüllprotein und die Sequenz für VIGS 6,7 verwendet. Inokulation von Nicotiana benthamiana und Tomatenjungpflanzen mit einer Mischung aus beiden Stämmen Ergebnisse in Gen-Silencing. Silencing des endogenen Phytoendesaturase (PDS)-Gen, das Bleichen verursacht, wird als Kontrolle für VIGS Effizienz eingesetzt. Es sollte angemerkt werden, ist jedoch, dass Schweigen in Tomaten in der Regel weniger effizient als in N. benthamiana. RNA-Transkript Fülle des Gens von Interesse sollte immer gemessen werden, um sicherzustellen, dass das Ziel-Gen effizient worden herunter reguliert werden. Dennoch heterologen Gensequenzen von N. benthamiana kann verwendet werden, um ihre jeweiligen Orthologe in Tomaten und umgekehrt 8 zum Schweigen zu bringen.
Protocol
Teil 1: Pflanzenmaterial
N. benthamiana Pflanzen zum Schweigen verwendet werden, sollten ca. 2 ½ Wochen alt, die ist die Zeit, wenn die Keimblätter und die ersten 2 bis 4 Laubblätter sind entstanden. 8 Tage Nachauflauf, wenn die Laubblätter noch nicht erschienen - Tomaten (Solanum lycopersicum) Anlagen sind 7 verwendet wird.
Teil 2: VIGS
TAG 1
- Für jeden Versuch sind Agrobacterium tumefaciens beherbergen pTRV1, pTRV2, pTRV2-PDS und pTRV2-host Zielgen auf LB-Agarplatten mit 50 pg / ml Kanamycin und 100 ug / mL Rifampicin ergänzt gewachsen. Die Kanamycin wählt für die pTRV Plasmid während der Rifampicin nicht so für die Agrobacterium. Die Platte bei 30 ° C für 2 Tage.
Silencing der PDS wird die Pflanzen photobleach Ursache und ist als Schweigen Erfolgskontrolle eingesetzt. Außerdem müssen die Gene herunterreguliert werden in eine pTRV2 Vektor kloniert werden. Es ist ein Gateway kompatibel pTRV2 Vektor, der die Klonierung zu erleichtern kann und wird von Liu et al. (2002).
TAG 3
- Impfen ein 2 bis 3 ml Flüssigkeit Kultur der LB mit den oben genannten Antibiotika für jeden der Stämme. Inkubieren durch Schütteln bei 30 ° C für 16 bis 18 Stunden und 200 rpm
TAG 4
- Impfen eine 1: 25 Verdünnung des primären Kultur in eine sekundäre Flüssigkeit Induction Media (IM) IM Kultur mit Kanamycin, Rifampicin und 200 uM Acetosyringon (Tabellen 1, 2 und 3). Die Acetosyringon ist als Induktor der vir-Gene von Agrobacterium, die für T-DNA-Transfer in der Anlage 9 erforderlich sind, während die IM ahmt die Umwelt dieses Erregers Begegnungen in den Host-Apoplasten verwendet. Inkubieren durch Schütteln bei 30 ° C für 20 bis 24 Stunden und 200 rpm
TAG 5
- Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren für 10 Minuten bei 3000 x g. Resuspendieren in das gleiche Volumen, dass die ursprüngliche Kultur mit 10 mM MgCl 2, 10 mM MES pH 5,5 hatte. Zellen können sanft gevortext werden, um sie zu resuspendieren.
- Centrifugue die Zellen wieder für 10 Minuten bei 3000 x g. Resuspendieren in die Hälfte des Volumens der ursprünglichen Kultur mit 10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,5.
- Bereiten Sie eine Bakteriensuspension mit einer OD 600 von 0,3 für jede Bakterienkultur. Add Acetosyringon bis zu einer Endkonzentration von 400 nM auf die pTRV1 Kultur.
- Mix der Kulturen mit dem pTRV1 und die pTRV2 (oder die pTRV2 enthält das Gen von Interesse) in einer 1 bis 1 Verhältnis. Auch eine pTRV2-PDS-Steuerung. Bitte beachten Sie, dass die endgültige Acetosyringon Konzentration ist jetzt 200 uM und dass jede Kultur bei einer OD 600 von 0,15.
- Beschriften Sie die Keimlinge mit dem Gen zum Schweigen gebracht werden und das Datum des Experiments infiltriert werden.
- Poke ein Loch in jedes Blatt mit einer Nadel infiltriert werden. Verwenden Sie einen 1 mL unnötige Spritze auf die Bakteriensuspension in die Sämlinge zu infiltrieren. Für Tomaten, infiltrieren beide Cotyledonen während für N. benthamiana, infiltrieren die beiden größten Laubblätter. Fünf ml jeder bakteriellen Mischung sollte ausreichen, um 15 N. infiltrieren benthamiana und 25 Tomatenjungpflanzen. Vermeiden Sie Kreuzkontaminationen, indem Handschuhe zwischen Infiltrationen und nicht die Bewässerung der Pflanzen bis zum nächsten Tag nach der Impfung.
- Die Pflanzen werden bei 20 gehalten - 22 ° C in einer Klimakammer mit einer 16-Stunden-Tag Länge und 50% RH für mindestens 3 ½ Wochen, bevor sie für Tests verwendet werden können.
Teil 3: Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Experiment mit N. benthamiana-und Tomatenpflanzen für PDS zum Schweigen gebracht. Pflanzen zeigen die charakteristischen photobleaching Phänotyp in Pflanzen mit verminderter Mengen an Carotinoiden beobachtet. Für die PDS-Schweigen Kontrollpflanzen, Bleichen beginnt, sobald 1 ersichtlich ½ Wochen nach Infiltration.
Abbildung 1. Silencing der PDS Kontroll-Gen verursacht Bleichen in N. benthamiana (A) und Tomaten (B)-Anlagen. Fotos wurden 3 ½ Wochen nach Schweigen aufgenommen.
Tabelle 1. Vorbereitung der Induction Medium (IM).
| 400 mL | destilliertem H 2 O |
| 4,88 g | MES (2 - (4 Morpholino)-ethansulfonsäure) |
| 2,5 g | Glucose |
| 0,12 g | NaH 2 PO 4 |
Bringen Sie zu einem Endvolumen von 475 ml mit dH 2 O und den pH-Wert auf 5,6. Autoclave. Nachdem das Medium abgekühlt, 25 ml 20x AB-Salze.
Tabelle 2. Vorbereitung der AB-Salze.
| 20 g | NH 4 Cl |
| 6 g | MgSO 4 · 7H 2 O |
| 3 g | KCl |
| 0,2 g | CaCl 2 |
| 0,05 g | FeSO 4 · 7H 2 O |
Bringen Sie zu einem Endvolumen von 1 Liter mit destilliertem Wasser. Autoclave. Seien Sie sich bewusst, dass AB Salze als orangefarbenes Pulver Niederschlag. Nur mischen sie gut durch Verwirbelung vor ihrer Verwendung.
Tabelle 3. Vorbereitung der 200 mM Acetosyringon. Bitte beachten Sie, dass Acetosyringon der Tag sie verwendet werden sollten darauf vorbereitet sein.
| 19,6 mg | Acetosyringon (3 ', 5'-Dimethoxy-4'-Hydroxyacetophenon) |
| 500 ul | DMSO (Dimethylsulfoxid) |
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Discussion
Virus-induzierte Gen-Silencing ist eine Methode, die eine schnelle reverse genetische Screens ermöglicht. Es vermeidet die Erzeugung von T-DNA oder Transposon-vermittelte Gen-Knock-outs, die nur in bestimmten Pflanzen wie Arabidopsis und Mais zur Verfügung. Zudem umgeht das zeitraubende Prozess der Transformation von Pflanzen und erlaubt das gezielte Vorgehen gegen mehrere Gene gleichzeitig, sofern sie eine ausreichende Homologie 10 oder dass unterschiedliche Host-Target-Sequenzen sind im Tandem in der Silencing-Vektor 6, 11 angeordnet sind.
Allerdings ist Schweigen nie 100% effizient und daher darauf zu achten, bei der Interpretation der Ergebnisse sein. Ein negatives Ergebnis kann einfach zeigen, dass die Rest-Protein-Konzentration ausreicht, um seine Funktion ohne offensichtliche phänotypische Folgen wurde. Auch sind einige Konstrukte besser zum Schweigen, als andere, so ist es immer ratsam, mindestens zwei verschiedene mRNA Regionen verwenden, um die Silencing-Konstrukte für jedes Gen zu generieren. Darüber hinaus gibt es immer die Möglichkeit von Off-Target-Silencing, wenn es ausreichende Homologie eines Gens mit dem Verstummen zu konstruieren, oder wenn sekundäre siRNAs, die transitive silencing führen können, entstehen 12. Dies gilt insbesondere für die Gen-Familien. Es ist daher von größter Bedeutung für die Wirksamkeit beim Verstummen von Ihrem Ziel und Off-Target-Gene zu quantifizieren, entweder durch RT-PCR oder Northern Blot-Analysen. Wenn RT-PCR als Methode zur VIGS Effizienz Schätzung gewählt wird, sollte einer der Primer an das Gen außerhalb der Region zum Schweigen zu bringen, so dass die Transkription durch das Virus produziert nicht auch verstärkt und die Ergebnisse wirklich den dowregulation gezielte Glühen einer bestimmten endogenen Gens.
VIGS Effizienz ist immer größer in N. benthamiana, als es in Tomate ist. Daher muss mit Vorsicht vorgegangen werden, wenn silencing Tomatenjungpflanzen werden. In Tomate, ist es entscheidend, die richtige Pflanze Entwicklungsstadium zu wählen und umweltgerechten Bedingungen für die virale Verbreitung zu erhalten. Außerdem muss Gentranskript Fülle für jede Anlage unter-Studie durchgeführt werden. Darüber hinaus, in der Regel in Tomaten VIGS, die A. tumefaciens Stamm GV3101 ist, während in N. benthamiana entweder GV3101 oder GV2260 sind 6,13 verwendet. Es ist möglich, ein Gen Verwendung einer heterologen Sequenz aus einer anderen Spezies, vorausgesetzt es ist ausreichend Homologie zwischen den beiden Stille. Auch bei der Konstruktion eines pTRV2-Zielgen Vektor sollte einzufügen Längen im Bereich von 200 bis 1000 bp werden und sie sollten nicht zählen homopolymere Regionen (zB Poly-A-Schwanz) 14.
Wenn die Kulturen trägt pTRV2 mit den Genen des Interesses mit PDS verunreinigt werden, manchmal nicht Ausbleichen beobachtet wird. Stattdessen werden Anlagen haben eine kürzere Statur. Daher ist es entscheidend, alle Quellen von Kreuzkontamination während des Experiments zu minimieren, die möglicherweise bias Ihre Ergebnisse.
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Acknowledgments
Wir danken Dr. Patricia Manosalva für ihre wertvolle Einblicke in das Manuskript. Die Finanzierung wurde von der National Science Foundation Pflanzengenomforschung Programm, Vergabe-Nummer DBI-0605059 zur Verfügung gestellt.
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