Imaging cellulare dal vivo di F-actina Dynamics tramite microscopia a fluorescenza Speckle (FSM)

Summary

Selezione, microiniezione, e l'imaging di fluorescenza marcata con F-actina tramite microscopia a fluorescenza speckle (FSM).

Abstract

In questo protocollo si descrivono l'uso della microscopia a fluorescenza Speckle (FSM) di catturare immagini ad alta risoluzione delle dinamiche di actina in cellule PtK1. Un vantaggio unico del FSM è la sua capacità di catturare il movimento e la cinetica fatturato (montaggio / smontaggio) della F-actina rete all'interno delle cellule viventi. Questa tecnica è particolarmente utile nel derivare misurazioni quantitative di F-actina dinamiche se abbinato con il software di visione artificiale (qFSM). Descriviamo la, microiniezione selezione e la visualizzazione di sonde fluorescenti actina in cellule viventi. È importante sottolineare che le procedure siano applicabili alla visualizzazione assemblee macomolecular altri. FSM è stata dimostrata per microtubuli, filamenti intermedi, e complessi di adesione.

Protocol

Sezione 1: Ottenere il vostro actina fluorescente per FSM

Materiali richiesti: purificato actina, fluoroforo (Alexa, X-rodamina consigliato). G-buffer, ultracentrifuga

1. Un componente chiave per l'acquisizione di filmati FSM buona impone l'etichettatura corretta di actina (o altre proteine ​​del citoscheletro) con il fluoroforo di vostra scelta.
   Si consiglia di utilizzare fluorofori di Alexa (488, 568 lunghezze d'onda) e X-rodamina derivati ​​esteri succinimidile che l'obiettivo esposto residui di lisina sulla superficie di actina.
2. Quando scegli il tuo fluoroforo e la sua lunghezza d'onda appropriata, assicurarsi che la configurazione microscopio ha i filtri appropriati (eccitazione ed emissione) e illuminatori (lampade a vapori di mercurio e / o laser) per soddisfare le vostre tag fluorescenti. Si consiglia di selezionare le lunghezze d'onda del rosso arancione per lunghezze d'onda (560-630 nm) per minimizzare gli effetti di auto-fluorescenza e foto-danni e per assicurare la sua compatibilità con GFP-coniugati.
3. Actina pura può essere estratto dal tessuto muscolare appartenente al ratto o di pollo, ma richiede una lunga procedura di estrazione di polvere muscolare acetone. Acetone polvere muscolo può essere acquistato da Invitrogen. La procedura di etichettatura non è discusso in questo protocollo, ma può essere trovato qui [1]
4. In alternativa, è possibile acquistare proteine ​​actina etichettato da molti editori tra cui Citoscheletro Inc. e Invitrogen. Servizi di etichettatura personalizzati sono disponibili anche tramite Invitrogen. Purificata, non marcata actina (actina sia muscolare e non muscolari) possono essere acquistati presso citoscheletro Inc.
5. Se si decide di acquistare o preparare il actina propria etichetta, si vuole assicurare che il rapporto di etichettatura è da qualche parte intorno 0,3-0,7 coloranti per monomero di actina. Troppo alto rapporto di etichettatura può effettuare la cinetica fatturato (e di legame con le proteine ​​associate) del filamento di actina, mentre troppo bassa con un rapporto di etichettatura porterà a poveri puntini guardando (basso segnale al rumore) e può causare problemi di microiniezione (vedi sotto). Questo è un fattore critico per ottenere una buona speckle immagini.
6. Prima di stoccaggio a lungo termine, la soluzione actina etichetta dovrebbe essere chiarita facendo girare a 75.000 - 80.000 xg per 20 minuti a 4 gradi Celsius. Actina etichettati devono essere conservati in G-soluzione tampone e tenuti -80 gradi Celsius. Preparazione di 2 aliquote uL è altamente raccomandato per ridurre gli effetti negativi di ripetute gelo-disgelo (porta ad aggregati insolubili). Evitare di esporre la soluzione actina marcato alla luce diretta (che photobleaching di fluorofori). Si consiglia di utilizzare tubi microcentrifuga opaco per una conservazione a lungo termine.

Sezione 2: Preparazione di cellule e Microiniezione di actina etichettati

Materiali richiesti: gli aghi microiniezione, microsiringa, microloaders, media cellula preriscaldata, buffer di iniezione, secchio di ghiaccio, microscopio (anello di fase, contrasto di fase obiettivo 40X, transjector, ago estrattore, micromanipolatore)

1. Molti tipi di cellule sono suscettibili di FSM, ma ottenere buone immagini speckle dipende direttamente il successo della procedura di microiniezione. Quando si selezionano le celle per FSM, le cellule devono essere di grandi dimensioni (> 50 um di diametro), dovrebbe diffondersi quando placcato, ed essere naturalmente aderente al substrato (o piatti di plastica coltura dei tessuti). Aiuta anche se citoplasma della cellula occupa una superficie superiore al suo nucleo. I criteri di cui sopra in modo che le cellule sono suscettibili di microiniezione. Successo linee cellulari candidato include (ma non solo) PtK1 [2,3], le cellule polmonari tritone [4], e neuroni Aplysia [3].
2. Le cellule devono essere placcato sul coprioggetto di vetro quadrata (22 x 22 mm;. Non 1-1/2) che sono stati lavata con acido. Rivestimento substrato standard può essere applicato al vetrino e non influenzerà microiniezione.
3. La corretta scelta di aghi microiniezione dipende dalle dimensioni della punta di apertura. Tipicamente, le dimensioni dei fori può molto nel formato da 0,5 um alla grande come 3 um. Tuttavia, si consiglia che l'iniezione di actina richiede una dimensione ottimale di apertura tra 0,5 e 1 um. Se i problemi di intasamento si incontrano costantemente, le dimensioni dei fori più grandi in grado di ospitare per la consegna di monomerico così come indesiderati filamenti di actina polimerizzata. Microiniezione aghi possono essere acquistati attraverso diversi fornitori, compresi i sistemi Eppendorf che rendono gli aghi microiniezione femtotip. In alternativa, se un estrattore ago commerciali è disponibile, tubi di microiniezione di vetro possono acquistato da Sutter, e tirò le specifiche. Per i principianti, si consiglia di avere 10-20 aghi tirati a portata di mano prima di iniziare la procedura di iniezione.
4. 'Concentrazione di iniezione' ideale (concentrazione finale di actina caricata nel vostro ago) di actina è compresa tra 0,5-1,0 ug / ul sulla base di un rapporto di etichettatura del 40% di tintura di monomero di actina. Rapporto di etichettatura inferiore del actina può essere compensata mediante iniezione a concentrazioni più elevate (1-3 ug / ul). Tuttavia, la frequenza intasamento del vostro ago siessere aumentata. Questo può essere in parte alleviati utilizzando aghi con le grandi aperture. Concentrazione stock di actina può essere diluita con l'aggiunta di ghiaccio freddo buffer di iniezione. Ghiacciata ddH2O può essere utilizzato anche per diluire per preparazioni iniettabili veloce. A questo punto tutte le soluzioni di lavoro devono essere tenuti in ghiaccio.
5. Carico 0,5-1,0 uL della soluzione di actina con una microsiringa (a scartamento ridotto - Hamilton), o in alternativa utilizzando una punta microloader pipetta.
6. Dispensare con cura la soluzione actina, delicatamente rilasciando la soluzione. Bolle dovrebbe essere evitato, ma può essere facilmente rimosso prendendo il liquido in eccesso che circonda la bolla.
7. Garantire che la soluzione actina è completamente a riposo la punta dell'ago. Soluzione in eccesso ovunque lungo il capillare dell'ago può interrompere il flusso di iniezione.
8. Ora, collegare l'ago con cura, evitando il contatto con la punta dell'ago, al titolare iniettore. Posizionare il supporto in modo che l'ago fa un angolo di 35-50 gradi alla base del palco microscopio. Angoli inferiori sono da preferire.
9. Abbassare la punta dell'ago finché non si rompe appena la superficie del supporto balneari vostre cellule.
10. Ora la posizione della punta dell'ago (senza abbassare) in modo che poggia direttamente sopra il centro dell'obiettivo. Se la punta dell'ago sia allineato con l'obiettivo, si dovrebbe vedere un alone luminoso attraverso l'oculare. Questa è la fine della punta dell'ago. Lentamente la parte dell'ago a lato (utilizzando il manipolatore) può aiutare a meglio individuare l'aureola.
11. Regolare la z-focus sul microscopio fino a quando le cellule sono in chiara visione. Ora, abbassare lentamente la punta fino a quando l'alone restringe via via fino alla fine convergono in punta dell'ago - è necessario controllare la messa a fuoco (z-position) contemporaneamente. Un ulteriore elemento atto a cercare è l'albero dell'ago, che proietteranno ombre lineare. Abbassare l'ago a poco a poco definire l'albero ago. Se fatto correttamente la fine del l'ago e le cellule devono essere entrambi in chiara visione. Leggero aggiustamento dell'anello di fase può essere necessaria per migliorare il contrasto.
12. Durante la navigazione, assicurare la punta dell'ago è ben al di sopra vostre cellule per prevenire rotture punta dell'ago.
13. Quando si sceglie di iniettare le cellule, le cellule con bordi liberi deve essere rivolto verso la punta dell'ago. Questo garantirà pendenza declino della cellula (dal punto più spesso, in cui risiede il nucleo, il punto più sottile bordo d'attacco) si riunirà la punta dell'ago, piuttosto che correre in parallelo ad esso.
14. La pressione ago deve essere fissato a 0,3-0,8 psi. La pressione costante applicata si tradurrà in un flusso costante della soluzione actina.
15. Dopo aver deciso su una cella per iniettare, posizionare l'ago in modo che il consiglio si trova accanto al nucleo (regione perinucleare, parte più spessa della cella in cui il nucleo non è direttamente sotto).
16. Abbassare lentamente, e regolare la posizione dell'ago fino a quando la punta è deprimente la membrana, ora in modo incrementale inferiore fino a quando la punta dell'ago ha forato la membrana. Se l'ago ha perforato la membrana, la cellula apparirà più luminosa, appena vedete questa differenza sollevare l'ago fino a quando non è più toccare il cellulare. Il piercing attuale e il processo di iniezione si ,5-2 secondi.
17. Se fatto correttamente, la forma della cellula appare immutato, mentre le iniezioni troppo si tradurrà in retrazione rapida del bordo delle cellule e in alcuni casi sarà effettivamente vedere la cellula esplodere.
18. Se non vedi cambiamenti nella cella quando microinjecting (non più luminosa), la punta dell'ago può essere chiuso. È possibile verificare questo premendo il tasto 'pulita' se disponibile sul transjector. Se aperto, questo aumenterà notevolmente il flusso costante della pressione che può essere visto attraverso gli oculari - apparirà come increspature e detriti vicino può essere visto dispersione.
19. Se la punta dell'ago è chiuso, è possibile scegliere di inserire un nuovo ago microiniezione o tentare di violare la punta dell'ago delicatamente abbassando l'ago fino alla punta delle presse aghi contro il coprioggetto di vetro, provocando così la fine della punta per rompere. La zona di rottura dovrebbe essere non più di un 1 / 5 ^° della zona del punto ago (la parte dell'ago che inizia a convergere verso un punto).
20. Continuare con l'iniezione, spendendo non più di 20 - 45 minuti per ogni sessione di microiniezione (dipende dal tipo di cellula). Come regola generale, più brevi sessioni sono raccomandate per ridurre al minimo lo stress sulle cellule.
21. Dopo aver terminato la microiniezione, cambiare il supporto delle cellule nel piatto con l'aggiunta di nuovi mezzi di comunicazione preriscaldata. Poi consentono alle cellule di recuperare per 30 minuti in un incubatore prima di imaging. Ciò consentirà anche l'actina di integrare nella rete esistente citoscheletro.

Sezione 3: Assemblaggio della Camera Imaging

Materiali richiesti: coprioggetti, nastro biadesivo, q-punte, pinze, valap, kim wipe, oxyrase, immagini dei media, lama di rasoio, p200 pipette, etanolo puro

1. Inizia preriscaldamento dei media di imaging e scongelamento di 15 uL aliquota di Oxyrase. Accertarsi di proteggere i oxyrase fotosensibile dalla luce. L'aggiunta di oxyrase ridurrà di molto gli effetti della photobleaching.
2. Preriscaldare il valap, impostando la temperatura piastra calda a bassa. Non surriscaldare / bruciare il valap per essa perderà la sua efficacia come sigillante.
3. Pulire il coprioggetti con un kimwipe bagnato con etanolo puro per pulire e rimuovere i detriti di piccole dimensioni.
4. Impilare due lunghezze uguali dimensioni (2,5 cm di lunghezza) di nastro biadesivo sulla parte superiore di ogni altro, con una superficie piana pulita come piattaforma. Spremere eventuali bolle d'aria intrappolate per creare un piano completamente piatto.
5. Utilizzando una lama di rasoio, tagliate due strisce dritto lungo l'asse longitudinale, in modo che ogni striscia misura 0,5 centimetri di larghezza.
6. Utilizzando pinze, luogo ogni striscia contro il bordo lungo del coprioggetti in modo che le due strisce di nastro crea un vuoto nel centro della vostra coprioggetti. Premere delicatamente sul nastro per fare un bel sigillo con il vetro. Le strisce di nastro agirà come distanziatori tra il coprioggetti e il coprioggetto.
7. Assicurarsi che il valap ha completamente liquefatto prima di iniziare il prossimo passo.
8. Recuperare i file multimediali di imaging preriscaldata, aggiungendo 15 ul di oxyrase ad ogni uL 500 di media.
9. Kimwipes piega in triangoli di creare 3 bordi duri. Questo sarà utilizzato per creare una superficie asciutta per il nastro di incollare.
10. Recuperare le cellule dal termostato. Utilizzando pinze, afferrare un angolo del coprioggetto. Rapidamente il posto su un vetrino kimwipe (lato cella è rivolto verso l'alto, senza toccare i tessuti), e utilizzare il kimwipe piegato per pulire due lati opposti del vetrino per creare un semi-secco superficie (sulla superficie dove il vostro riposo cellule).
11. Utilizzando pinze, afferrare un angolo il coprioggetto e posizionarlo sul coprioggetti in modo che le superfici asciutte sono allineati a due strisce di nastro. Si noti ora si hanno due lati chiusi e due fessure aperte. Lentamente Pipettare 200 ul di soluzione di imaging-media-oxyrase vicino ad una apertura. Soprattutto, assenza di bolle d'aria dovrebbe essere introdotta. La soluzione deve essere aspirato nella camera appena assemblato da forze capillari, immergendo in tal modo le cellule in soluzione.
12. Utilizzando un Q-tip tamponare i quattro angoli del coprioggetto con valap fuso apporre in modo rapido e stabilizzare il coprioggetto. Noterete che le asciuga valap istantaneamente (in pochi secondi a temperatura ambiente).
13. Ora comincia con i lati aperti (non nastro lato), c'era una sottile striscia di valap utilizzando un Q-tip e mimando un colpo di spazzola. Ripetere l'operazione per i lati chiusi. Lentamente costruire la mano di valap, rafforzando così il sigillo ripetendo i passaggi di rivestimento. Il valap deve essere limitato ai bordi, lasciando al centro del coprioggetto chiaro.
14. Pulire delicatamente la parte centrale del vetrino utilizzando un Q-tip con ddH2O di rimuovere il media residua, essere attenti a non rompere le cellule. Ripetere la pulizia passo con etanolo puro.
15. Ora avrete una camera di imaging completamente chiusa ottimizzata per speckle imaging. Avere un involucro completamente sigillato impedisce al fluorofori da subito photobleaching.

Sezione 4: cellule Imaging

Materiali richiesti: microscopio invertito widefield, lampada mecury, filtri del caso, raffreddato CCD con pixel di 6,7 micron, ad alta apertura numerica, olio-immersion piano-apocromatico obiettivi (60X a 100X, fase o DIC). Vibrazioni tavolo. Software di imaging.

1. Preriscaldare il palco microscopio a 37 gradi. Inserisci la tua camera di imaging recentemente completato, e attendere 10-15 minuti per la temperatura si stabilizzi prima di imaging.
2. Inizio mettendo a fuoco le tue cellule a Bright-campo, e poi trovare le cellule iniettate commutando le impostazioni corrette fluorescenza. Cercare di minimizzare il tempo di esposizione fluorescenza per ridurre photobleaching.
3. Ricerca di cellule iniettate che sono sani bordi curvi leader. Over-iniettate cellule (cellule esploso) sarà caratterizzata da bordi frastagliati e retratto, simile filopodia numerosi - evitare di imaging queste cellule.
4. Impostazioni di acquisizione dipenderà dal tipo di cellula, la qualità della actina marcato, e componenti del microscopio. Tuttavia, le impostazioni di esposizione non deve essere superiore a 2 secondi, e l'intervallo di tempo tra i fotogrammi deve essere impostato tra 5 e 10 secondi. Lunghezze tipiche di una serie temporale (per cella fotografato) può variare dai 10 ai 30 minuti, ed è limitata dagli effetti photobleaching. Impostazioni di guadagno sulla fotocamera può essere attivata fino a aumentare il segnale al rumore.
5. Ideale speckle caratteristiche dovrebbe avere ogni speckle intervallata da ~ 2 speckle diametri alla vicina prossimo speckle. Questo garantisce ottimale di campionamento spaziale e temporale della struttura di actina. Per le cellule epiteliali, la rete di actina punteggiato apparirà omogeneo, con macchie uniformemente divaricate. Linee cellulari che dispongono di fibre di stress densa o lamellipodiasaranno distinguibili, ma avrà un aspetto punteggiato / maculato. Le impostazioni di esposizione deve essere regolata per ottenere le migliori immagini punteggiato.
6. Over-microiniettati cellule avranno macchie fitte, che non sembrano essere discreti. Fibre di stress e la lamellipodia perderà il suo aspetto punteggiato.
7. Under microiniettati cellule apparirà molto fioca attraverso l'oculare, contenente macchie che sono distanti tra loro (> 10 macchie a parte) e appaiono casualmente sparsi. Fibre di stress e la lamellipodia in queste cellule non sarà diversa.
8. Chiave per ottenere 'buono' speckle film mantiene a fuoco. Ciò è particolarmente importante per la post-analisi che coinvolgono speckle flusso e misure fatturato. Così la qualità dell'analisi quantitativa dipenderà blocco nel punto di riferimento per tutta la durata del time-lapse. Questo può essere particolarmente difficile se il piano di imaging è molto sottile. Altri fattori dipenderà dalla stabilità del sistema microscopio, in particolare l'alloggiamento palco e la camera di imaging. Contrasto a base di messa a fuoco può essere utilizzato se intervallo di lunghezze immagini sono sufficienti per accogliere questa funzione. Altre opzioni includono l'acquisto di un vicino infrarosso sistema basato messa a fuoco che fornisce affidabile modifiche in tempo reale messa a fuoco. È possibile trovare queste offerte da Nikon, Olympus e ASI.

Sezione 5: analisi qFSM

Questa sezione non è discusso in dettaglio, ma le informazioni sul software di analisi può essere trovato qui [5]. Richieste di download del software possono essere effettuate sul nostro sito (lccb.scripps.edu).

Argomenti trattati:

• Rumore di calibrazione
• Speckle rilevamento
• Monitoraggio utilizzando un approccio ibrido tra immagine correlazione basata tracciamento del moto di grossa speckle aree e monitoraggio singola particella del moto dettagliata di macchie individuali.
• Calcolo del gruppo di polimeri e dei tassi di smontaggio dalle fluttuazioni di intensità durante speckle comparsa e scomparsa eventi.

Discussion

Diversi sono i fattori chiave fondamentale per riuscire a ottenere immagini speckle, per quanto buone macchioline iniziano e terminano con la qualità della vostra actina fluorescente. Un rapporto di etichettatura elevati di colorante di actina monomero, disposti intorno a 0,4-0,7 farà in modo che puntini apparirà luminoso e discreto, mentre la proteina etichettata stesso dovrebbe essere solubile e priva di aggregati. Altrettanto importante è la procedura di microiniezione. Per assicurare la normale omeostasi cellulare (e la sopravvivenza), le cellule devono essere iniettato con una pressione a basso flusso, l'introduzione di una bassa concentrazione di proteina marcata. Ciò richiede un certo grado di competenza tecnica / esperienza per l'utilizzo del sistema di microiniezione. Come regola generale, i tempi di iniezione più brevi (<1s) sono preferiti ai tempi di iniezione più lunghi. L'ultima componente cruciale è il microscopio. Un microscopio invertito accoppiato con un mercurio lampada epi-illuminatore, si trovano in strutture più core, servirà come piattaforma adeguata per speckle imaging. Supponendo che la appositi filtri fluorescenza sono in atto, la combinazione di un obiettivo ad alta NA e una camera CCD raffreddata produce immagini ad alta risoluzione di macchie luminose. Si consiglia di utilizzare ad alto ingrandimento (100X), alta NA (> 1,3), il piano-apocromatico obiettivi in ​​grado di fornire elevata risoluzione e luminosità. In condizioni ideali di iniezione, l'ingrandimento può essere abbassata a 60X, aumentando la luminosità e SNR per pixel. Basso rumore, alta efficienza quantica, fotocamere CCD raffreddata, con dimensioni dei pixel di circa 6,5 ​​micron sono rivelatori di ideali, e in alcuni casi può compensare le sonde fluorescenti scarsa qualità. Inoltre, le sonde proteina fluorescente può essere co-iniettata con costrutti di cDNA (nucleoinjection) per esprimere la GFP / RFP proteine ​​coniugate all'interno della cellula stessa. Ciò richiede l'nucleoinjection di cDNA nei nuclei delle cellule, seguita da una seconda iniezione nel citoplasma circostante. In sintesi, FSM fornisce intuizioni senza precedenti nella dinamica del citoscheletro. Ottenere macchioline buona richiede le sonde corretta, le attrezzature e un po 'di pazienza (formazione).

Materials

Injection buffer (IB) 50 mM potassium glutamate 0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A) Store up to 2 years at −20° C G-buffer 2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A) 0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A) Add just before use: 0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM) 0.5 mM 2-mercapt–thanol Store up to 1 day at 4° C