蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

Summary

選択、マイクロインジェクション、および蛍光を経由して蛍光標識F -アクチンのイメージング顕微鏡（FSM）のスペック。

Abstract

このプロトコルでは、蛍光の使用を説明しPtK1細胞におけるアクチンダイナミクスの高解像度の画像をキャプチャするために顕微鏡（FSM）のスペック。 FSMのユニークな利点は、生きた細胞内でF -アクチンのネットワークの移動と回転率の動態（組立/分解）をキャプチャする機能です。この手法は、コンピュータビジョンのソフトウェア（qFSM）と組み合わせた場合、F -アクチンのダイナミクスの定量的な測定値を導出する場合に特に便利です。我々は生きた細胞内の蛍光アクチンプローブの選択、マイクロインジェクションおよび視覚化について説明します。重要なことは、同様の手順では、他のmacomolecularアセンブリの可視化に適用可能である。 FSMは、微小管、中間径フィラメント、及び接着複合体のために実証されている。

Protocol

セクション1：FSMについては、蛍光標識アクチンを取得

必要な材料：精製アクチン、フルオロフォア（アレクサ、X -ローダミンを推奨）。 G -バッファ、超遠心

1. 良好なFSMのムービーを取得するために重要なコンポーネントは、任意の蛍光体とアクチンの適切なラベルを（または他の細胞骨格タンパク質）が必要です。
   我々は、アレクサ（488、568波長）とアクチンの表面に露出リジン残基を標的とX -ローダミンスクシンイミジルエステル誘導体の蛍光物質を使用することをお勧めします。
2. あなたの蛍光体とその適切な波長を選択するときには、顕微鏡のセットアップは、蛍光タグに対応するために適切なフィルター（励起及び放射）及び照明器を（水銀アークランプ及び/またはレーザー）があることを確認してください。我々は、自家蛍光と光損傷の影響を最小限にするとGFP -複合体との互換性を確保するために赤色の波長（560〜630 nm）にオレンジ色の波長を選択することをお勧めします。
3. 純粋なアクチンは、ラットやチキンに属する筋肉組織から抽出しますが、筋肉のアセトンパウダーから長い抽出手順を必要とすることができます。筋肉のアセトンパウダーは、Invitrogenから購入することができます。標識手順は、このプロトコルで説明されていませんが、ここで[1]見つけることができます
4. また、この細胞骨格株式会社、およびInvitrogenを含む複数のベンダーから分類アクチンタンパク質を購入することができます。カスタムラベルのサービスは、Invitrogen社からも入手できます。精製された、非標識アクチン（筋肉と非筋肉のアクチンの両方）は、細胞骨格（株）から購入することができます。
5. あなた自身のラベルの付いたアクチンを購入したり、準備するかには、ラベリングの比率がアクチンのモノマー当たり0.3から0.7染料の周りのどこかになるようにしたいとします。高すぎるとラベルの比率が低すぎるの標識率が低い探して斑点（ノイズの低信号）につながる一方、アクチンフィラメントのターンオーバー速度を（および関連するタンパク質に結合する）影響を与える可能性がありますのでマイクロインジェクションの問題を（下記参照）が発生することがあります。これは良いが、画像のスペックル取得するための重要な要素です。
6. 長期保管する前に、標識されたアクチンのソリューションは、75000で回転によって明らかにされるべきである - 摂氏4度で20分間8万XG。標識されたアクチンはG -緩衝液中で保存され、摂氏-80℃を維持する必要があります。 2 ulのアリコートを準備することを強く繰り返し凍結融解（不溶性凝集体に至る）の有害な影響を軽減することをお勧めします。 （フルオロフォアの光退色になります）直接光に標識したアクチンのソリューションを公開することは避けてください。我々は、長期保管のために不透明なマイクロ遠心チューブを使用することをお勧めします。

セクション2：というラベルの付いたアクチンの細胞とインジェクションの調製

必要な材料：マイクロインジェクションの針、マイクロシリンジ、microloaders、あらかじめ温めておいたセルのメディア、インジェクションバッファー、氷のバケツ、顕微鏡（40倍、位相リング、位相コントラストの目標、transjector、ニードルプラー、マイクロマニピュレータ）

1. 多くの細胞型は、FSMに従順ですが、良いが、画像のスペックル取得すると、マイクロインジェクションの手順の成功に直接依存します。 FSMのためのセルを選択する際には、細胞が（直径> 50 UM）大きさが必要、時メッキ広がり、そして基板（またはプラスチック製組織培養皿）に自然に付着しているはず。細胞の細胞質ゾルは、その核よりも大きい面積を占める場合にも役立ちます。上述の基準は、細胞がマイクロインジェクションに従順であることを確認してください。合格者の細胞株は、（これらに限定されない）PtK1 [2,3]、イモリの肺細胞[4]、及びアメフラシの神経細胞[3]が含まれます。
2. 酸洗浄されている;セルは正方形のガラス製カバースリップ（無1-1/2 ... 22 × 22 mm）に播種してください。標準的な基板のコーティングは、カバースリップに適用することができ、マイクロインジェクションには影響しません。
3. マイクロインジェクションの針の正しい選択は、先端の開口部の大きさに依存しています。一般的に、穴のサイズは非常にサイズでは0.5ミクロンから同じ大きさ3のようなUMにすることができます。しかし、我々はアクチンの注入は0.5〜1μMの間の最適な開口部のサイズを必要とすることをお勧めします。目詰まりの問題が常に発生した場合は、大きい穴のサイズは、単量体の配信だけでなく、不要な重合したアクチンフィラメントのために収容することができます。マイクロインジェクションの針はfemtotipマイクロインジェクションの針を作るエッペンドルフシステムを含むいくつかのベンダーから購入することができます。商業用ニードルの引き手が使用可能であれば別の方法として、ガラスのマイクロインジェクション管はサッタから購入し、仕様にプルアップすることができます。初心者のために、我々は注射の手順を開始する前に手に10〜20プル針を持ってお勧めします。
4. アクチンの理想的な"注入濃度"（あなたの針にロードされているアクチンの最終濃度）は、アクチンの単量体への染料の40％の標識率に基づいて、0.5から1.0 UG / ulの間です。あなたのアクチンの低い標識率は、高濃度（1-3 UG / UL）で注入することによって補償することができる。ただし、針の目詰まり頻度がなりますであるが増加。これは、部分的に大きな開口部と針を使用することによって軽減することができます。アクチンのストック濃度は、氷冷インジェクションバッファーを加えて希釈することができます。氷冷ddH2Oにも迅速に注射のために希釈するために使用することができます。この時点ですべての作業のソリューションは、氷上で保存する。
5. 、あるいはmicroloaderピペットチップを使用して - マイクロシリンジを使用して、アクチン溶液の1.0 UL（ハミルトン狭軌）に0.5をロードする。
6. 慎重にゆっくりとソリューションを放出することによって、アクチン溶液を分注する。気泡は避ける必要がありますが、簡単に泡を囲む余分な液体を取ることによって除去することができます。
7. アクチンのソリューションは、針の先端に完全に置かれていることを確認してください。どこでも針の毛細管に沿って余分な溶液は、注入の流れを中断させることができる。
8. 今、慎重にインジェクターホルダーに、針の先端との接触を避け、針を取り付けます。針が顕微鏡ステージのベースに35から50度の角度を成すようにホルダーを配置します。下の角度が好ましい。
9. それはほとんどあなたの細胞を浸して、メディアの表面を解除するまで、針の先端を下げます。
10. それが直接の目的の中心より上側に休むように今、針の先端を（低下させることなく）配置します。針の先端が目標と整合している場合は、接眼レンズを通して明るいハローが表示されるはずです。これは、針の先端の終わりです。ゆっくり（マニピュレータを使用して）側に針側を移動するには、ハローを見つけるより役立つことがあります。
11. あなたの細胞は、クリアな視界になるまで、顕微鏡のZフォーカスを調整します。今、最終的に針の先端に収束するまで、ハローは、徐々に収縮するまでゆっくりと先端を下げる - あなたは、同時にフォーカス（Z位置）を制御する必要があります。を探すために追加の機能では、線形影を投影される針のシャフト、です。針を小さくすると、徐々にニードルシャフトを定義します。正しく完了したら針とあなたの細胞の最後は、両方のクリアな視界にする必要があります。位相リングの微調整は、コントラストを改善するために必要となる場合があります。
12. 移動するときに、針の先端が針の先端を壊さないためにもあなたの細胞の上であることを確認してください。
13. 注入する細胞を選択する際には、フリーエッジを持つ細胞は、針の先端に直面する必要があります。これはむしろそれと平行に走るよりも、針の先端を満たす（核が先端最薄部に、存在する厚い点、から）細胞の減少勾配を確保します。
14. 針圧は0.3から0.8 psiで設定する必要があります。適用される一定の圧力は、アクチン溶液の定常流になります。
15. 先端は核（核周辺領域、核が直接下にはないセルの厚い部分）の横にあるので、注入するためにセルを決定したら、あなたの針を合わせます。
16. 徐々に低くし、針の先端が膜を貫通するまで、チップは現在、徐々に下の膜を押下されるまで、針の位置を再調整。針が完全に膜を貫通している場合は、セルとすぐに、それはもはや細胞に触れていないされるまで、この違いは、針を上げる参照として、明るく表示されます。実際のピアスと注入プロセスは、0.5〜2秒かかります。
17. あまりにも多くの注入は、セル端の迅速な退縮をもたらすのに対し、正しく完了したら、セルの形状は、変更されずに表示され、いくつかのケースでは、実際にセルが爆発するが表示されます。
18. （明るい取得していない）マイクロインジェクションする際にセル内の変更が表示されない場合は、針の先端が閉じることができます。あなたのtransjectorで利用可能な場合"クリーン"ボタンを押すことで、これをテストすることができます。開いている場合、これは大幅に接眼レンズを通して見ることができる一定の圧力流量を増加する - 波紋と近くの破片が分散見られるようにそれが表示されます。
19. 針の先端が閉じている場合、あなたは、このように先端の非常に端を引き起こして、静かにガラスのカバースリップに対して針を押すの先端まで針を下げることにより、針の先端を破る新しいマイクロインジェクションの針や試みを挿入するかを選択できますブレークへ。破損領域には、ニードルポイント（点に収束し始める針の部分）の面積の1 / ⁵日を超えてはならない。
20. （細胞の種類に依存します）、各マイクロインジェクションのセッションの45分 - 20を超えないを費やして、注射を続行します。一般的なルールとして、短いセッションが細胞のストレスを最小限に抑えることを推奨されています。
21. マイクロインジェクションを終えた後、新鮮な温めておいた培地を追加して皿に細胞培地を変更してください。その後、細胞がイメージングの前にインキュベーター内で30分間回復することができます。これはまた、既存の細胞骨格のネットワークに統合するアクチンが可能になります。

セクション3：イメージングチャンバーの組み立て

必要な材料：カバーガラス、両面テープ、綿棒、ピンセット、valap、キムワイプ、oxyrase、画像メディア、かみそり刃、P200πpette、純粋なエタノール

1. イメージングメディアを予熱しOxyrase 15 uLのアリコートを解凍することから始めます。光から感光oxyraseを保護することを確認してください。 oxyraseの加算は、大幅に光退色の影響を減らします。
2. ローにホットプレートの温度を設定することにより、valapをPrewarm。それは、封止剤としてその有効性を失うことになるためのvalapを過熱/燃やさないでください。
3. 小さな破片を掃除したり削除したりする純粋なエタノールでdousedキムワイプでカバーガラスを拭いてください。
4. プラットフォームとしてきれいで平らな面を使用して、互いの上に両面テープの二つの等しいサイズの長さを（2.5センチ）スタック。完全に平らな平面を作成するために閉じ込められた空気の泡を押してください。
5. カミソリの刃を使用して、各ストリップは幅0.5センチメートルを測定するように、長軸に沿って2つの直線ストリップをカット。
6. 鉗子を使用して、テープの2つのストリップは、カバーガラスの中心にあるギャップを作成するように、カバーガラスの長辺に対して各ストリップを配置。グラスで素敵なシールを作るためにテープを軽く押します。テープのストリップは、カバーガラスとカバーガラスの間にスペーサーとして機能します。
7. 次の手順を開始する前にvalapが完全に液状化していることを確認してください。
8. メディアのすべての500μLのためoxyraseの15 ULを追加して、温めておいたイメージングメディアを取り出す。
9. 3ハードエッジを作成するために三角形に折りキムワイプ。これは、上固執するテープの乾燥した表面を作成するために使用されます。
10. インキュベーターから細胞を取得します。鉗子を使用して、カバーの角をつかむ。すぐにキムワイプ（セル側組織に触れていない、上を向いている）にカバースリップを置き、半乾燥した表面を（表面上の細胞の残り）を作成するためにカバースリップの対向する二辺を拭くために折り畳まれたキムワイプを使用。
11. 鉗子を使用して、コーナーのカバースリップを取得し、乾燥した表面はテープの2つのストリップに整列されるように、カバーガラスの上に置きます。 2つの閉鎖の側面およびつのオープンスリットを持っている、今注目してください。近い一方の開口に、イメージング、メディアoxyraseソリューションのゆっくりとピペット200μlの。重要なのは、に気泡を導入するべきではありません。解決策は、このように完全なソリューションであなたの細胞を浸し、毛細管力によって、新たに組み立てられたチャンバーに吸い上げてください。
12. Q -ティップDAB迅速に付するように溶融valapとあなたのカバースリップの四隅を使用し、カバースリップを安定化。あなたは即座にvalap乾く（室温で秒以内）ことがわかります。
13. 今オープンサイド（非テープ側）から始まる、Q -ティップを使用し、ブラッシングのストロークを模倣することによってvalapの薄いストリップが横たわっていた。閉鎖の側面について、この手順を繰り返します。徐々にこうしてコーティングの手順を繰り返すことで、シールを強化、valapのコートを構築する。 valapはクリアカバーの中央を残し、エッジに限定されるべきである。
14. 細胞を破砕しないように留意され、任意の残留メディアを削除するにはddH2OでQ -ティップを使用してカバーの中央部を静かに清掃してください。純粋なエタノールで洗浄ステップを繰り返します。
15. これで画像のスペックルに最適化された完全密閉イメージング室を持つことになります。完全に密閉されたエンクロージャを持つことは、すぐに退色からフルオロフォアを防止します。

セクション4：イメージング細胞

必要な材料：倒立広視野顕微鏡、mecuryランプ、適切なフィルターは、6.7ミクロンピクセル、高開口数、油浸プラン - アポクロマート対物レンズ（60X 100倍に、位相またはDIC）とCCDカメラを冷却する。振動テーブル。イメージングソフトウェア。

1. 37度に顕微鏡ステージをPrewarm。新しく完成したイメージング室を配置し、イメージングの前に安定させるために温度の10〜15分待ちます。
2. ブライトフィールドであなたの細胞を集中させ起動し、正しい蛍光設定を切り替えて、あなたの注入された細胞を見つける。退色減らすために蛍光露出の時間を最小限に抑えるようにしてください。
3. 健康な曲線縁を持って注入された細胞を探します。過剰注入された細胞は、（展開された細胞）数々の糸状仮足に似た、撤回とギザギザのエッジによって特徴付けされる - イメージングこれらの細胞を避ける。
4. 買収の設定は、セルのタイプ、ラベルされたアクチンの品質、及び顕微鏡のコンポーネントに依存します。しかし、露出の設定は2秒を超えてはならない、とフレーム間の時間間隔は5秒と10秒の間で設定する必要があります。時系列の典型的な長さは（画像化されたセルあたり）どこか10〜30分間の間に変化することができる、と退色​​の影響によって制限されます。カメラのゲイン設定は、ノイズへの信号を増加させるまでにすることができます。
5. 理想的な特性が各スペック〜2を隔てているはずですスペックは、近隣のスペックルの横に直径スペックル。これは、アクチンの構造の最適な空間的および時間的サンプリングが保証されます。上皮細胞の場合は、斑点のアクチンのネットワークは、均等に広げます斑点で、均一な表示されます。緻密なストレスファイバーや葉状仮足を特色細胞株区別されますが、点線/斑入りの外観を持つことになります。露出の設定は、最高の斑点の画像を得るために調整する必要があります。
6. オーバーマイクロインジェクション細胞が離散的であることが表示されない密集斑点を持つことになります。ストレスファイバーと葉状仮足は、その点線の外観を失うことになる。
7. アンダーマイクロインジェクション細胞が離れている（> 10スペックル離れて）と散らばってランダムに現れる斑点を含む、接眼レンズを通して非常に暗く表示されます。これらの細胞におけるストレスファイバーと葉状仮足は区別されます。
8. "良い​​"を入手するにはムービーがフォーカスを維持しているスペック。これは、フローと売上高の測定をスペック含むポスト解析のために特に重要です。したがって、定量分析の品質が時間経過の間、焦点でのロックに依存します。結像面が非常に薄い場合、これは特に挑戦することができます。他の要因は、特に顕微鏡システムの安定性、ステージのハウジングとイメージングチャンバーに依存します。画像の間隔の長さは、この機能に対応するために十分であるかどうコントラストベースのフォーカシングを使用することができます。その他のオプションは、信頼性の高いリアルタイムのフォーカス調整を提供する近赤外ベースの集光システムを購入含まれています。あなたは、ニコン、オリンパスとASIからこれらの製品を見つけることができます。

第5節：qFSM分析

このセクションは、詳細に議論されていないが、解析ソフトウェアの詳細については[5]ここで見つけることができます。ソフトウェアのダウンロード要求は、当社のウェブサイト（lccb.scripps.edu）で行うことができます。

トピックがカバー：

• ノイズのキャリブレーション
• 検出のスペック
• 画像相関ベースの領域と、個々のスペックルの詳細な運動の単一の粒子の追跡をスペックルの粗動の追跡のハイブリッドアプローチを使用して追跡。
• 中強度の変動からのポリマーの組み立てと分解率の計算は、外観と消失イベントをスペックル。

Discussion

いくつかの重要な要素が正常に画像のスペックル得るために不可欠な、しかし良い斑点が開始して、蛍光標識アクチンの品質で終了。標識タンパク質自体が水溶性と凝集体の自由でなければならないしながら0.4から0.7の周りに設定されたアクチン単量体への染料の高いラベリングの比率は、、斑点が明るいと離散的に表示されるようになります。同様に重要なマイクロインジェクションの手順です。 （と生存）、正常な細胞の恒常性を確保するために、細胞は標識タンパク質の低濃度の導入、低流量の圧力で注入する必要があります。これは、マイクロインジェクションシステムの使用に関する技術的専門知識/経験のある程度が必要です。一般的なルールとして、短い噴射時間（<1秒）より長い注入時間よりも優先されています。最後の重要なコンポーネントは顕微鏡です。ほとんどの中核施設で見られる水銀ランプ落射照明、と対に倒立顕微鏡は、画像のスペックルのために適切なプラットフォームとして機能します。高NAの対物と冷却CCDカメラの組み合わせは、明るい斑点の高解像度の画像を生成する、適切な蛍光フィルターがきちんと整っていると仮定する。我々は、高倍率（100倍）、高NA（> 1.3）、優れた解像度と明るさを提供する計画-アポクロマートの目標を使用することをお勧めします。理想的な注入条件の下で、倍率は、ピクセルごとに明るさとSNRを増加させる、60Xに下げることができる。 〜6.5ミクロンのピクセルサイズを持つ低ノイズ、高量子効率、冷却CCDカメラは、理想的な検出器であり、いくつかのケースでは低品質蛍光プローブを補正することができます。さらに、蛍光標識タンパク質プローブは、同じ細胞内でGFP / RFP共役タンパク質を発現するcDNA構築物（nucleoinjection）と共注入することができる。これは、周囲の細胞質に目の注射に続いて、細胞の核へのcDNAのnucleoinjectionが必要です。要約すると、FSMは、細胞骨格のダイナミクスに前例のない洞察を提​​供します。良い斑点を得ることは、適切なプローブ、機器と少しの忍耐（訓練）が必要です。

Materials

Injection buffer (IB) 50 mM potassium glutamate 0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A) Store up to 2 years at −20° C G-buffer 2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A) 0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A) Add just before use: 0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM) 0.5 mM 2-mercapt–thanol Store up to 1 day at 4° C