Summary
يوصف بروتوكول قصيرة لتلطيخ البروتين مع Coomassie بريليانت الأزرق (المصرف المركزي) G - 250 في المواد الهلامية بولي أكريلاميد دون استخدام مذيبات عضوية أو حمض الخليك في الإجراءات تلطيخ الكلاسيكية مع المصرف المركزي.
Abstract
الكلاسيكية في تلطيخ البروتين باستخدام بروتوكولات Coomassie بريليانت الأزرق (المصرف المركزي) ، وحلول مع محتويات عالية من المذيبات العضوية السامة والقابلة للاشتعال (الميثانول والايثانول أو 2 بروبانول) وحامض الخليك يتم استخدامها من أجل التثبيت ، وتلطيخ destaining من البروتينات في هلام بعد SDS صفحة. لتسريع الإجراء ، والتدفئة الحل تلطيخ في المايكرويف لفترة قصيرة وتستخدم بشكل متكرر. هذه النتائج عادة في تبخر الميثانول السامة أو الخطرة ، والإيثانول أو 2 بروبانول ورائحة قوية من حمض الخليك في المختبر والتي ينبغي تجنبها لاعتبارات السلامة. في بروتوكول نشر أصلا في طلبات براءات الاختراع اثنين من Wondrak EM (US2001046709 (A1) ، US6319720 (B1)) ، يوصف تركيبة بديل من الحل تلطيخ الذي يستخدم في أي مذيب عضوي أو حامض. يذوب في الماء المصرف المركزي bidistilled (60 - 80mg من المصرف المركزي ليتر لكل G - 250) ويضاف حمض الهيدروكلوريك 35 مم والمجمع الوحيد الآخر في حل تلطيخ. تتم staning المصرف المركزي من هلام بعد الغسيل SDS - PAGE وشامل من هلام في الماء bidistilled. عن طريق تسخين هلام أثناء الغسيل وتلطيخ الخطوات ، يمكن الانتهاء من عملية أسرع وليس compunds السامة أو الخطرة يتم تبخير. لتلطيخ من البروتينات يحدث بالفعل في حدود 1 بعد دقيقة والتدفئة الجل في تلطيخ الحل ويتم تطويره بالكامل بعد 15-30 دقيقة مع خلفية زرقاء قليلا أن destained تماما عن طريق الغسيل لمدة طويلة الجل الملون في الماء bidistilled ، دون أن يؤثر هذا البروتين الملون العصابات.
Protocol
الجزء 1 : إعداد الحل تلطيخ المصرف المركزي
- 60-80 ملغ من المصرف المركزي تذاب G - 250 في 1 ليتر من المياه بواسطة bidistilled التحريك لمدة 2-4 ساعات. أخيرا ، يضاف 3 مل من حمض الهيدروكلوريك تتركز على حل الأزرق الداكن مع التحريك لمدة دقيقة وتخزينها في الظلام لاستخدامها لاحقا. ويمكن تخزين الحل لأسابيع عدة أشهر دون أن تفقد كفاءتها تلطيخ.
- يجب التعامل مع حمض الهيدروكلوريك تتركز اوند الرعاية المعتادة المستخدمة تحت غطاء الدخان. الحل النهائي وسوف تكون على درجة الحموضة حوالي 2 ، وتستخدم لذلك يجب أن تكون القفازات وينبغي تجنب أي اتصال مع الجلد.
الجزء 2 : SDS - PAGE
- تختلط aliquots المناسبة من البروتين مع عينات تحميل العازلة إلى التركيز النهائي للتحميل 1X العازلة. نستخدم 2X العازلة التحميل مع 125mM Tris/H3PO4 (7.5 درجة الحموضة عند 25 درجة مئوية) ، 2mm وEDTA ، SDS 4 ٪ ، DTT 200MM ، الأزرق bromophenol 0.02 ٪ والجلسرين 50 ٪. ويمكن استخدام مخازن أخرى لتحميل SDS - PAGE كذلك.
- يتم تسخين عينات البروتين لمدة 5 دقائق قبل التحميل. وفي الوقت نفسه ، على استعداد الغرفة الكهربائي للهلام للتشغيل. نستخدم الجاهزة NuPAGE 4-12 ٪ © مكرر تريس المواد الهلامية (Invitrogen) في SureLock XCell ® مصغرة الخلية (Invitrogen) مع MES العازلة باعتبارها منطقة عازلة تشغيل ولكن أي هلام الأخرى والنظام الكهربائي يمكن استخدامها كذلك.
- يتم تحميلها على عينات البروتين جل وتشغيل الكهربائي لمدة 50 دقيقة في 220V.
الجزء 3 : يلطخ من هلام
- غير مفككة كاسيت جل وهلام وضعت في صندوق للخطوات اللاحقة الغسيل.
- يضاف حوالي 100 مل من الماء إلى هلام bidistilled وتسخينها في المايكرويف لمدة 30 ثانية. يجب أن تتوقف قبل الغليان يحدث التدفئة. ثم يتم وضع مربع مع الجل على شاكر لمدة 3-5 دقيقة. ويتم تكرار هذه الخطوة غسل مرتين مع المياه العذبة.
- يضاف ما يكفي من حل تلطيخ المصرف المركزي لتغطية جل في خانة ومربع ساخنة في الميكروويف لمدة 10 ثانية. دون الغليان. ثم يتم وضع مربع مع الجل على شاكر عن الانتهاء من تلطيخ. بالفعل بعد 1 دقيقة ، يمكن ملاحظة الفرق البروتين ، وبعد 15-30 دقيقة. لتلطيخ قوية بما فيه الكفاية في معظم الحالات.
- يسكب الحل تلطيخ قبالة ويضاف 50-100 مل ماء bidistilled من أجل مزيد من الخلفية يزيل اللون الأزرق الفاتح من الجل على شاكر. يمكن استبدال الماء عن طريق المياه العذبة لdestaining أخرى إذا لزم الأمر.
- ويمكن تفحص جل وتصويرها أو تجفيفه لتخزين الطويل الأجل
الجزء 4 : النتائج الممثل :
انظر الشكل. 1 لهلام ملون بشكل صحيح بعد الإجراء وصفها.
انظر الشكل. 2 لهلام التي لم يتم غسلها قبل فترة طويلة بما فيه الكفاية وتلطيخ SDS المتبقية يحول دون تلطيخ كفاءة. علما بأن الممرات علامة (*) تحتوي على نفس كمية البروتينات علامة.
التين. 1 : هلام الممثل الملون بعد تحميل عينات من تنقية البروتين (* : علامة الجزيئية الوزن).
التين. 2 : المصرف المركزي الجل الملون التي لم يتم غسلها قبل فترة طويلة بما فيه الكفاية تلطيخ المصرف المركزي. الفرق البروتين تظهر ضعفا (لاحظ أن علامة * حارة يحتوي على نفس كمية البروتين كما في الشكل رقم 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
- خطوات غسل حاسمة لتلطيخ كفاءة من البروتينات. ويمكن لتقليل الوقت غسل أقل من 2 دقيقة أو انخفاض حجم المياه (<50ml) ينتج بروتين نطاقات شاحبة اللون الأزرق ، وعلى الأرجح بسبب ارتفاع كميات SDS المتبقية في هلام.
- إذا البروتينات ستكون تحليلها بواسطة مطياف الكتلة ، يجب أن يتم تخطي الخطوات التسخين في فرن الميكروويف ، والوقت للاغتسال من هلام تمتد إلى حوالي 10 دقيقة في كل خطوة والوقت تلطيخ تمديدها حتى كثافة الفرقة هي قوية بما فيه الكفاية . ويمكن تسخين النتائج هلام في يشابك من البروتينات إلى المصفوفة هلام ، وبالتالي الكشف عن البروتينات التي مطياف الكتلة أعاقه.
- بدلا من المصرف المركزي G - 250 ، يمكن للمرء استخدام R - 250 المصرف المركزي وفقا للبروتوكول الأصلي Wondrak. نحن لم مقارنة جانبي الأصباغ الى جنب كما كان لدينا مخزون من المصرف المركزي G - 250 في مختبرنا وكانت النتائج جيدة مع هذه الصبغة.
- سرعة الإجراء وإغفال المذيبات السامة أو الخطرة في خطوات الغسيل وتلطيخ هي أهم العوامل ومقنعة لاستخدام هذا البروتوكول. حساسية في نفس نطاق البروتوكولات الكلاسيكية تلطيخ المصرف المركزي والتجاري والمصرف المركزي حلول تلطيخ لم يكن عاملا مقيدا لتحليل SDS - PAGE لدينا في مجال التعبير وتنقية البروتينات المؤتلف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا المصالح المتضاربة. ووصف الإجراء أعلاه نشرت أصلا في طلب البراءة من قبل Wondrak م (انظر المرجع).
Acknowledgments
نود أن نعترف المساعدة التقنية من Racké إيناس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | any other CBB G-250 could be used as well |
| Concentrated HCl |
References
- Process for fast visualization of protein. US patent. Wondrak, E. M. , 6319720 (B1) (2001).
- Solution for fast visualization of protein. US patent. Wondrak, E. M. , 2001046709 (A1) (2001).
