Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

Summary

Coomassie Brillant Blue (CBB) poliakrilamid jeller G-250 ile protein boyanması için kısa bir protokol CBB ile klasik boyama işlemleri gibi organik çözücüler veya asetik asit kullanmadan açıklanmıştır.

Abstract

Coomassie Brillant Blue (CBB), toksik ve yanıcı organik çözücüler (Metanol, Etanol ve 2-propanol) ve asetik asit içeriği ile çözümler kullanarak klasik protein boyama protokolleri, fiksasyon için kullanılan boyama ve SDS sonra bir jel proteinlerin destaining -PAGE. Kısa bir süre mikrodalga fırında ısıtma, boyama çözüm prosedürü hızlandırmak için sık sık kullanılır. Bu genellikle toksik veya tehlikeli Metanol, Etanol ve 2-Propanol ve güvenliği ile ilgili hususlar nedeniyle kaçınılmalıdır laboratuar asetik asit güçlü bir koku buharlaşması sonuçlanır. EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)) tarafından iki patent başvurularının yayınlanan bir protokol, boyama çözüm alternatif bir kompozisyon solvent organik veya asit olduğu açıklanmıştır. CBB bidistile su içinde çözünmüş (CBB G-250 litre başına 60-80mg) ve 35 mM HCl boyama çözüm sadece bileşik olarak eklenir. Jel CBB staning bidistile su jel SDS-PAGE ve kapsamlı yıkandıktan sonra yapılır. Yıkama sırasında jel ısıtma ve adımları boyama, sürecin daha hızlı bitmiş olması ve herhangi bir toksik veya zararlı bileşiklerin buharlaşan. Proteinlerin boyama boyama çözüm jel ısıttıktan sonra 1 dakika içinde zaten ortaya çıkar ve tamamen lekeli protein etkilemeden, bidistile su ile boyanan jel uzun süreli yıkama tamamen destained bir hafif mavi arka plan ile 15-30 dakika sonra geliştirilen bantlar.

Protocol

Bölüm 1: CBB boyama çözüm Hazırlık

1. 60-80 mg CBB, G-250, 2-4 saat süreyle karıştırılarak 1 litre bidistile su içerisinde çözülür. Son olarak, bir dakika karıştırarak 3 ml konsantre HCl ile koyu mavi bir çözüm eklenir ve karanlıkta daha sonra kullanılmak üzere depolanır. Çözüm boyama verimliliği kaybetmeden birkaç ay hafta kadar saklanabilir.
2. Konsantre HCl olağan bakım ve davlumbaz altında ele alınmalıdır. Nihai çözüm pH yaklaşık 2 eldiven kullanılmalıdır olmalı ve herhangi bir cilt ile temasından kaçınılmalıdır.

Bölüm 2: SDS-PAGE

1. Protein örneklerinin uygun alikotları 1x yükleme tamponu nihai konsantrasyonu tampon yükleme ile karıştırılır. Biz Tris/H3PO4 125mm (25 ° C'de pH 7.5), 2mm EDTA,% 4 SDS, 200mm DTT,% 0.02 Bromophenol Mavi ve% 50 gliserol ile 2x yükleme tamponu kullanın. SDS-PAGE Diğer yükleme tamponlar da kullanılabilir.
2. Protein örnekleri yüklemeden önce yaklaşık 5 dakika süreyle ısıtılır. Bu arada, jel elektroforezi odası çalıştırmak için hazırlanmıştır. Biz bir XCell SureLock © Bis-Tris jeller (Invitrogen) ® MES-tampon Mini-Cell (Invitrogen) yanı sıra çalışan tampon ancak başka herhangi bir jel elektroforez sistemi kullanılabilir prekast 4-12% NuPAGE kullanın.
3. Protein örnekleri 220V az 50 dakika süreyle çalıştırın jel ve elektroforez yüklenir.

Bölüm 3: jel boyanması

1. Jel kaset demonte ve jel, çamaşır sonraki adımlar için bir kutu yerleştirilir.
2. Bidistile su yaklaşık 100 ml jel eklenir ve 30 saniye süreyle mikrodalga fırında ısıtılır. Kaynama meydana gelmeden önce Isıtma kesilmelidir. Kutu jel ile 3-5 dakika sonra bir çalkalayıcı yerleştirilir. ve bu yıkama adım temiz su ile iki kez tekrarlanır.
3. Yeter CBB boyama çözüm kutuya jel ve 10 saniye süreyle mikrodalga fırında ısıtılır kutu kapsayacak şekilde eklenir. kaynama olmadan. Jel ile kutu boyama bitirdikten sonra bir çalkalayıcı yerleştirilir. Zaten 1 dakika sonra, 15-30 dakika sonra protein bantları gözlenebilir. boyama çoğu durumda yeterince güçlü.
4. Boyama çözüm dökülür ve 50-100 ml bidistile su daha açık mavi renkli bir çalkalayıcı üzerinde jel destain için eklenir. Gerekirse daha destaining için su, taze su ile değiştirilebilir.
5. Jel, taranmış fotoğraflandı veya uzun süreli depolama için kurutulur.

Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları:

Bkz: Şekil. 1 açıklanan prosedürü izleyerek düzgün lekeli bir jel.

Bkz: Şekil. Boyama ve artık SDS önce yeterince uzun değil yıkanmamış bir jel için 2 verimli boyama engeller. Marker proteinlerin aynı miktarda marker şerit (*) içerdiğini unutmayın.

Şekil 1: Bir protein saflaştırılması örnekleri (moleküler ağırlık belirteci *) yükledikten sonra Temsilcisi jel boyandı.

Şekil 2: CBB boyama önce yeterince uzun yıkanmış olmamıştır CBB boyanan jel. Protein bantları (marker şeritli * Şekil olarak aynı miktarda protein 1 içerdiğine dikkat) zayıf görünür.

Discussion

• Çamaşır adımlar proteinleri etkili bir şekilde boyanması için kritik. 2 dakika veya hacim azalması (<50 ml) su altında bir azalma yıkama süresi, yüksek miktarda jel artık SDS nedeniyle büyük olasılıkla soluk mavi protein bantları, neden olabilir.
• Proteinler, kütle spektrometresi ile analiz olacak ise, mikrodalga fırında ısıtma adımları atlanabilir, her adımda yaklaşık 10 dk ve grubun yoğunluğu kadar uzatıldı boyama süresi uzatıldı jel yıkama için yeterince güçlü . Kütle spektrometresi jel matriks ve böylece proteinleri tespit proteinlerin crosslinking jel sonuçları Isıtma engel olabilir.
• CBB G-250 yerine, bir Wondrak tarafından orijinal protokole göre CBB R-250 kullanabilirsiniz. Bizim laboratuvar CBB G-250, bir hisse senedi vardı ve bu boya ile iyi sonuçlar olduğu gibi boyalar yan yan iki karşılaştırıldığında değil.
• Işlem hızı ve zehirli veya zararlı çözücüler, yıkama ve boyama adımları ihmal bu protokolü kullanarak en önemli ve ikna edici faktörler. Hassasiyeti klasik CBB boyama protokolleri ve ticari CBB boyama çözümleri aynı aralıkta ve ifade ve rekombinant proteinlerin saflaştırılması alanında SDS-PAGE analizi için sınırlayıcı bir faktör olmamıştır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coomassie Brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480	any other CBB G-250 could be used as well
Concentrated HCl