Summary
ミツバチは、食欲の嗅覚学習のパラダイム（PER -コンディショニング）で条件付けることができます。刺激として匂いを使用して、我々は、同時にカルシウムイメージングがキノコ体ニューロンの匂い誘発活性を測定するために使用されている間に記録されている動作にする方法を確立
Abstract
生体とセミのカルシウムイメージングのためのin vivoでの準備でカットナーとGaliziaは、触角葉1の臭気誘発活性を測定するために、十年以上前に、Joergesによって私たちの研究室で開発されています。その時から、それが継続的に洗練されており、ミツバチの脳の異なるneuropilesに適用される。ここで、我々は現在、デキストラン結合のカルシウム感受性色素（フラ-2）を使用して、キノコ体の神経細胞で活性を測定するために実験室で使用されている準備について説明します。我々は、逆行軸索や細胞体の領域に色素を注入することによりキノコ体の神経細胞を染色。我々は、それがコンディショニングのPERを使用してハチを訓練することは可能である準備を達成するために、侵襲性を減らすことに焦点を当てる。我々は、PER（M17）2を制御する筋肉からの電気myogramsを記録することによって、行動反応を監視し、定量化することができます。
生理学的実験の後に画像形成された構造は、ニューロンの識別に対処するための走査型共焦点顕微鏡を用いてより詳細に検討されています。
Protocol
蜂の準備とバックフィル
- 固定化のため氷の上でハイブとチルでミツバチの飼料収穫機をキャッチ。
- プレキシグラス録音室3でマウントします。低融点のハードワックスとレコーディング室の壁に目と胸部を修正。
- 一般的に電気生理学のために使用されるガラスキャピラリーを引いて、CAの先端径を得るために先端に壊れる。 10μmの。染料ペーストとキャピラリーの先端をカバーしています。染料ペーストは、フラ-2デキストランおよびリジン修正可能なテトラメチルローダミンデキストランの10:1混合物で構成されています。
- 染色手順のために特徴点またはn -エイコサンとアンテナを固定する。脳上記のキューティクルの一部を削除し、キノコ体へのアクセスを許可する側に腺と気管を押してください。
- ソーマやキノコ体の神経細胞の軸索領域のいずれかに毛細血管を注入する。これは、フリーハンドを行ったり、マイクロマニピュレータを使用することができます。その後、頭部カプセルでキューティクル部分を復元し、アンテナを緩めます。
- 20℃で少なくとも4時間または一晩加湿場合にそれらを格納する前に、30％ショ糖溶液と蜂を養う℃に
生体内撮像
- 腹部に押し付けると、録音室にクリップやテープで固定されているスポンジの小片で蜂などの動きを妨げる。
- 食道の汲み上げに起因する脳の動きを防ぐために、唇上記のキューティクルに小さな切開を切断し、食道の4を損なうことなく、緊張下に置くために慎重に食道とその周囲の固体構造を引き出します。二成分シリコーンをカバー。
- 針で穴を確認し、M17の記録のためのワイヤ電極を挿入する。
- キューティクル部分、気管、脳、上記の腺を削除します。一枚の紙で頭部カプセル内heamolymphを吸う。
- 二成分シリコーンを頭のカプセルを埋める。脳が完全に覆われていることが重要です。
- 場所を顕微鏡ステージ上に蜂と液滴に顕微鏡のディップの目標を浸すために、シリコンの表面に水滴を置く。ステンドニューロンに焦点を当てる。
信号の匂いの刺激と記録
嗅覚：我々は、コンピュータ制御された、カスタム構築された刺激装置またはGaliziaとフェッター3で前述したように"嗅覚"を使用。悪臭は、アンテナに向け一定の空気流中に希釈されています。あらゆる刺激は、0.2ミリリットル臭い飽和空気の3S臭のパルスで構成されています。刺激のプロトコルは、録音ソフトウェアTILLVisionに設定することができます。
顕微鏡とイメージングセットアップ：我々はツァイス蛍光顕微鏡を使用する。画像は25 °顕微鏡に搭載されたTILLフォトニクスイメージング装置を用いて5 Hzのサンプリングレートを持つCで記録されている。カルシウムの信号はX60、0.9 Wオリンパス成虫CCDカメラ（640x480ピクセル、160x120ピクセルのチップ上でビニング4X）とディップ目的によって記録されます。フラ-2は、レシオメトリックな測定のための340および380nmの波長の単色光で励起される。蛍光は、410nmのダイクロイックミラーと440nmロングパスフィルタを介して検出されます。記録のためのパラメータは、レコーディングソフトウェアで設定されます。各測定には2つの波長に対して10秒と露光時間をそれぞれ準備の染色強度に調整することができます続きます。
M17の記録：唇（M17）の伸筋が学習に関連する行動反応を監視するために細胞外記録され、PER 5、6、すなわち。口の部分に近い筋肉に銅線を注入する。目に接地電極を注入する。筋肉の電位は、カスタムビルドプリアンプで増幅デジタル化してコンピュータに保存されます。刺激の発症は、嗅覚によってトリガされます。
データ解析
- 実験中：カルシウム信号の録音は、コンピュータに供給され、格納されています。レコーディングソフトウェアのTILLVisionは波長（340nm/380nm）とdeltaF（ベースラインの減算）の計算の間の比率の計算のように、信号の最初の検査が可能になります。
- 画像処理は、IDLでカスタム作成されたプログラムで実行されます。のCa 2の比を計算する+各ピクセルの340nmと380nmの測定値からの信号を。刺激前のフレームにわたって平均化することにより、バックグラウンド蛍光（F）を決定し、レシオメトリック信号（deltaF）から差し引きます。
- 対象領域（ROI）を定義するには：刺激中にフレームの平均とローパスフィルタ（3X3px）を適用する計算。偽色のスケールにグレースケールに変換します。偽色の画像でのアクティビティのスポットとしてニューロン構造の活動を決定し、ROIとして定義する。
- いかなるフィルタリングまたは修正することなくすべてのフレームにわたってROI内のピクセルを平均化することにより活性領域の時間的なダイナミクスを計算する。
一緒にフラ-2デキストランで我々は解決不能色素ローダミンデキストラン（"ミニルビー"）でニューロンを埋める。両方の色素は同じ分子量を有し、それらは神経細胞に共存する必要があります。広視野イメージングは非常に限られた空間分解能を可能にする、従ってそれは、走査型共焦点顕微鏡を用いて実験した後に染色した構造を調べることをお勧めします。
- 生理学的測定の後、脳を解剖し、凝視する。
- PBSおよびエタノールとメチルsalycilateで明確に段階的に脱水にすすいでください。
- 共焦点顕微鏡のためのメチルsalycilateで脳を埋め込みます。
- 私たちは、ライカTCS SP2顕微鏡を使用してください。励起波長は543nmです。
- 我々は、空気や油浸対物レンズで脳をスキャンし、画像データで染色した構造を比較する。
代表的な結果：
染色と準備が成功した場合、偽色のスケールに信号は、キノコ体α葉外因性ニューロンで、例えば、図1のようになります。
行動反応は（PER）刺激（図2）の前に刺激マイナススパイクの周波数の間にスパイク頻度として計算することができます。
ステンド構造は、共焦点顕微鏡（図3）を用いてより詳細に検討されることがあります。
図1：代表的なカルシウムイメージングの信号（ヘプタナール刺激）。 ：蜂の脳の画像化された地域。 B：380nm励起波長におけるX20ディップ客観を通して見た、キノコ体のα-葉は紫色で概説されている生の蛍光画像。染料は、外因性神経細胞を染色するためにα-ローブの腹外側縁に注入した。 C：3つの第2の刺激の間の平均信号、deltaF（380分の340）に由来する偽色の画像、α-葉紫、黒に記載されている選択されたROIに記載されている。 D：匂いの刺激、C. Eに示すように関心領域から平均的な信号に応答してカルシウムシグナルの時空間ダイナミクス：ROIにそれぞれショ糖の刺激IPSI -と対側のアンテナへの応答におけるカルシウムシグナルの時空間ダイナミクスが示されたC.で
図2：代表M17応答。嗅覚コンディショニング後蜂は匂いが報酬なしで提示される口吻を拡張します。赤い線は臭いの刺激を示している。挿入図：ミツバチのPER。
図3：代表画像スタック。イメージング実験後に脳を解剖した。図1からニューロンは紫で概説X20の油浸対物レンズ、α-ローブに共焦点顕微鏡を用いてスキャンされます。
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Discussion
このプレゼンテーションでは、ミツバチの in vivoカルシウムシグナルに調査するためにすべてのステップを経ています。我々は、キノコ体の神経細胞にこの手法を適用し、が、画像は、染色技術を確立することができるため、すべてのニューロンに行われることがあります。我々は、ミツバチの嗅覚路における神経細胞に焦点を当てている。実験はすべて暗室で行われる。セットは、最大蜂の光学的認識の範囲外にあると染料を励起しない長波長の光で照らされている。それはシリコンで例の空気の泡のために、任意の蛍光アーチファクトを回避することが重要です。
このシステムの大きな利点の一つは、空間分解能と時間分解能を持つニューロンの活動に関する情報をサンプリングする可能性があります。ニューロンの例学習関連の可塑性を調査するときに、同時に、我々は蜂に関連する動作を観察することがあります。しかし、空間分解能と時間分解能が制限されています。 生体内のカルシウムイメージングで使用して、実験時間は限られている。細胞外電気生理学的手法で、レコーディングは数時間または数日間続くことができる、一方で、我々の実験は約90分に制限されています。我々はそれぞれ5Hzのサンプリングレート、10秒間続く各測定、340nm露光さ20ミリと380nm露光持続5msの、二つの波長で励起で85の測定を実行するときに信号が依然としてかなり良いです。その後、問題になる可能性がある色素漂白。
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Acknowledgments
この作業はDFGによって運営されている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| low melting point hard wax Deiberit 502 | Dr. Böhme Schöps Dental GmbH | ||
| FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW | Invitrogen | F-3029 | Protect from light. |
| tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW | Invitrogen | D-3312 | Protect from light. |
| n-eicosane | Sigma-Aldrich | 21, 927-4 | |
| Kwik Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | KWIK SIL | |
| Imaging Set-up | TILL Photonics | ||
| CCD camera | Imago | ||
| CED | Texas Instruments |
References
- Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain. Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).
- Rehder, V. Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings. J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).
- Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).
- Mauelshagen, J. Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain. J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ. Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera. Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).
