Summary
蜜蜂可以调节食欲嗅觉学习范式（每空调）。作为刺激的气味，我们建立了一个行为记录的同时，钙成像是用来衡量蘑菇体神经元的气味诱发活动的方法
Abstract
在体内和半体内钙成像准备在我们的实验室已开发Joerges，库特纳和Galizia十几年前，来衡量在触角叶1的气味诱发的活动。从那时起，它一直不断完善和应用在蜜蜂大脑中的不同neuropiles。在这里，我们描述了目前在实验室中用来测量使用葡聚糖加上钙敏感染料（FURA - 2）在蘑菇体神经元活动的准备。我们逆行染色注入其轴突的染料或SOMA地区的蘑菇体神经元。我们专注于减少的侵袭，达到了准备，它仍然是可能培养的蜜蜂，每空调使用的。我们是能够监测和量化的行为反应录音电myograms肌肉控制的PER（M17）2。
后生理实验成像结构更大的使用共焦扫描显微镜的详细地址的神经元的身份进行调查。
Protocol
蜜蜂的制备及回填
- 赶上在蜂房和关于固定冰的寒意蜜蜂觅食。
- 安装在有机玻璃录音商会3。低熔点硬蜡录音室的墙壁修复眼睛和胸部。
- 拉玻璃毛细管，俗称为电，突破，并在尖端获得了CA的尖端直径。 10μm的。盖毛细管尖端的染料粘贴。染料粘贴由一个10:1混合FURA - 2葡聚糖和赖氨酸可修复四甲右旋糖酐。
- 对于染色过程中，固定天线与细枝末节或正二十烷。取出一块上面的大脑角质层和腺体和气管推到一边允许访问的蘑菇体。
- 注入到蘑菇体神经元的胞体或轴突地区的毛细血管。这是可以做到放开手脚或使用微机器人。然后恢复角质层的一块头胶囊和松开天线。
- 30％的蔗糖溶液蜜蜂饲料存储在加湿的情况下，至少有四个小时前，或在夜间20 ° C。
活体成像
- 防止蜜蜂，例如运动的海绵小块，压腹部，并用一个夹子或磁带录音室固定。
- 为了防止大脑造成食道抽水的运动，角质层以上唇切成一小切口，小心地拉出食管和其周围的固体结构，把张力下，在不损害食道4。封面有两个组分硅酮。
- 用针的孔，并插入M17录音电极丝。
- 删除角质层片，气管和腺体以上的大脑。吸里面的一张纸头胶囊heamolymph。
- 填充双组分硅酮头囊。重要的是，大脑是完全覆盖。
- 蜜蜂在显微镜阶段和地方的水的硅沉浸到液滴显微镜浸目标表面上的下降。专注于染色的神经元。
气味的刺激和记录信号
嗅觉：我们使用计算机控制的，定制的刺激装置或Galizia和Vetter 3前面所述的“嗅觉” 。气味是稀释针对触角到一个恒定的空气流。任何刺激包括一个3S0.2毫升气味饱和空气的气味脉冲。可以设置在录制软件TILLVision刺激协议。
显微镜和影像设置：我们使用了蔡司荧光显微镜。在25 ° 5 Hz的采样率使用一个免耕光电成像设备安装在显微镜的彗星图像记录。钙信号记录通过一个X60的0.9 W，奥林巴斯DIP与意象CCD相机（640x480像素，160x120像素芯片分级4X）的目标。 FURA - 2是兴奋与340和380nm的比例测量波长的单色光。荧光检测到通过410nm分色镜和一个440nm的长通滤波器。录音软件录制的参数设置。每次测量持续10S和两个波长的曝光时间可以进行调整，以准备在每个染色强度。
M17录音：阴唇（M17）量角器肌肉细胞外记录到监控与学习的行为反应，即每五，六 。注入口部位的肌肉铜线。接地电极注入眼。肌肉潜力与自定义生成预放大器放大，数字化，并存储在计算机上。刺激呈现所引发的嗅觉。
数据分析
- 在实验过程中钙信号的录音送入一台计算机和存储。录音软件TILLVision允许信号的初步检查，如之间的波长（340nm/380nm）和deltaF（基准加减）计算的比例计算。
- 自定义编写的IDL程序进行图像处理。比例计算的Ca 2 +信号从340nm的测量和380nm的每个像素。确定背景荧光（F）和刺激前的平均帧减去比例的信号（deltaF）。
- 要定义区域利息率（ROI）：计算平均帧期间的刺激，适用于低通滤波器（3X3px）。灰度转换伪彩色规模。确定假彩色图像中的活动点的神经细胞结构的活动，并定义为投资回报率。
- 计算平均无任何过滤或更正的投资回报率超过所有帧像素的时空动态的活跃的地区。
连同FURA - 2右旋糖酐填写与可修复染料罗丹明右旋糖酐（“小红宝石”）的神经元。这两种染料具有相同的分子量;他们应在神经元合署办公。宽视场成像只允许非常有限的空间分辨率，因此建议使用共焦扫描显微镜的实验调查后染色结构。
- 生理测量后，解剖大脑和注视。
- 冲洗PBS和乙醇和甲基salycilate明确逐步脱水。
- 共聚焦显微镜嵌入甲基salycilate大脑。
- 我们使用了Leica TCS SP2的显微镜。激发波长为543nm。
- 我们用空气或油浸物镜扫描大脑成像数据进行比较的染色结构。
代表性的成果：
如果染色和准备是成功的，假色标信号，例如蘑菇体阿尔法叶外在神经元，可能看起来像图1。
行为反应（PER），可以计算出在刺激减去前刺激（图2）尖峰频率尖峰频率。
染色结构，可在更大的使用共聚焦显微镜（图3）的详细调查。
图1：代表钙成像的信号（刺激与庚） 。答：蜜蜂的大脑成像区域。乙：通过激发波长在380nm的一个X20 DIP目标的原始荧光图像，蘑菇体的α-叶概述紫色。注入α-叶腹外侧轮辋染料染色外在的神经元。选定的ROI：deltaF（三百八分之三百四十零），平均信号，在第二轮刺激派生的假彩色图像;α-叶紫色概述，概述了黑色。 D：钙信号的时空动态响应气味的刺激，从感兴趣的区域的平均信号C.电子表示：钙信号的时空动态响应蔗糖刺激IPSI和对侧天线的投资回报率分别表示在C
图2：代表M17的反应。蜜蜂的嗅觉调节后延伸时所发出的气味，没有奖励的长鼻。红线表示刺激气味。插图：蜜蜂人均。
图3：形象代表栈。成像实验后的大脑解剖。从图1中的神经元是使用一个X20的油浸目标，在紫色概述α-瓣共聚焦显微镜扫描。
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Discussion
在此演示中，我们经历过的所有步骤 ，以调查在蜜蜂体内的钙信号。我们应用这种技术的蘑菇体神经元，但可能对神经元的染色技术可以建立完成成像。我们一直专注于蜜蜂的嗅觉通路中的神经元。实验都是在暗室进行。设立是长波光线照射位于蜜蜂的光学感知范围，并没有激发染料。重要的是要避免任何荧光文物，例如气泡在硅。
这个系统的主要优点之一是样品在空间和时间分辨率的神经元活动的信息的可能性。同时，我们可以观察蜜蜂的相关行为进行调查时，如神经元在学习相关的可塑性。然而，在空间和时间分辨率是有限的。 体内钙成像技术的使用，实验时间是有限的。同时，随着外的电生理方法，录音，可以持续数小时或数天，我们的实验是有限的90分钟左右。信号仍然相当不错，当我们执行一个5Hz的采样率，每次测量持续10秒，20ms和380nm的曝光持久5ms的340nm的曝光，分别由两个波长85测量与激励。之后染料漂白可能会成为一个问题。
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Acknowledgments
这项工作是由东风集团。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| low melting point hard wax Deiberit 502 | Dr. Böhme Schöps Dental GmbH | ||
| FURA-2 dextran potassium salt, 10 000 MW | Invitrogen | F-3029 | Protect from light. |
| tetramethylrhodamine dextran 10 000 MW | Invitrogen | D-3312 | Protect from light. |
| n-eicosane | Sigma-Aldrich | 21, 927-4 | |
| Kwik Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | KWIK SIL | |
| Imaging Set-up | TILL Photonics | ||
| CCD camera | Imago | ||
| CED | Texas Instruments |
References
- Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain. Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).
- Rehder, V. Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings. J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).
- Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).
- Mauelshagen, J. Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain. J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).
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- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera. Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).
