Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

Summary

Este protocolo describe el uso de la microinyección y la imagen de alta resolución en el

Abstract

Este protocolo describe el uso del embrión de Drosophila melanogaster sincitial para el estudio de la mitosis ^1. Drosophila tiene una genética útil con un genoma secuenciado, y puede ser fácil de mantener y manipular. Muchos mutantes de mitosis existen, y las moscas transgénicas que expresan funcionales fluorescente (GFP, por ejemplo) - etiquetado proteínas mitótico han estado y están generando. Expresión de genes diana es posible utilizar el sistema GAL4/UAS ^2.

El embrión de Drosophila temprana lleva a cabo múltiples mitosis muy rápidamente (la duración del ciclo celular, ≈ 10 min). Es muy adecuado para obtener imágenes de la mitosis, ya que durante los ciclos de 10-13, los núcleos se dividen rápidamente y de forma sincrónica sin intervenir citocinesis en la superficie del embrión en una sola monocapa justo debajo de la corteza cerebral. Estos núcleos se dividen rápidamente, probablemente el uso de la maquinaria mitótica igual que otras células, pero que están optimizados para la velocidad, el puesto de control general, se cree que no se estrictas, lo que permite el estudio de las proteínas mitótico cuya ausencia podría causar detención del ciclo celular en células con un control fuerte . Los embriones que expresan proteínas GFP etiquetados o microinyección con la etiqueta fluorescente proteínas pueden ser fácilmente imágenes para seguir la dinámica de vida (Fig. 1). Además, los embriones pueden ser microinyección con el bloqueo de la función-anticuerpos o inhibidores de proteínas específicas para estudiar el efecto de la pérdida o la perturbación de su función ^3. Estos reactivos se difunden en todo el embrión, llegando a muchos ejes para producir un gradiente de concentración del inhibidor, lo que a su vez se traduce en un gradiente de defectos comparable a una serie de alelos de mutantes. Idealmente, si la proteína diana es marcado con fluorescencia, el gradiente de inhibición se puede visualizar directamente ^4. Se supone que el más fuerte fenotipo es comparable con el fenotipo nulo, a pesar de que es difícil excluir formalmente la posibilidad de que los anticuerpos pueden tener efectos dominantes en raras ocasiones, los controles tan rigurosos y una prudente interpretación debe ser aplicada. Más lejos del sitio de la inyección, la función de proteínas es sólo parcialmente perdido permitir otras funciones de la proteína diana a hacerse evidente.

Protocol

Recetas:

Placas de jugo de uvas:

• 5,5 g de agar Bacto
• 14,5 g de dextrosa o glucosa
• 7,15 g de sacarosa
• 45 ml de jugo concentrado de uva (jugo 100%).
• 204.5 ml H ₂ 0
• 625 l de NaOH 10N

Mezcle todos los ingredientes y horno de microondas hasta que hierva.
Añadir la mezcla 2,8 ml de ácido (mezcla de ácidos: 20,9 ml de ácido propiónico, 2,1 ml de ácido fosfórico, 27 ml H ₂ 0)

Mezclar y verter en placas de Petri de 35 mm. Deje que solidifique a temperatura ambiente durante uno o dos días. Si las placas no se va a utilizar muy pronto, sellar con parafilm y se mantenga a 4 ° C (hasta que se estabilice a RT antes de usar).

Levadura pasta:

Disuelva una cucharadita de levadura (Sigma YSC2, la levadura Saccharomyces cerevisiae de tipo II) en agua para formar una pasta espesa. Coloque una pequeña cantidad de esta en cada placa de jugo de uva antes de su uso.

G-PEM buffer:

• 80 mM Na-TUBOS, pH 6,9
• MgCl2 1 _mM
• 1 mM EGTA
• 1 mM GTP

Inyección de tampón:

• 150 mM K-aspartato
• 10 mM K-fosfato
• 20 mM imidazol, pH 7,2

Heptano cola:

Desenrollar cinta adhesiva de doble pegajosa y colocar en un frasco de 100 ml, agregar aproximadamente 50 ml de heptano, el sello de la botella, y el rock durante varios días. Cuando se utiliza, agrega heptano si la cola es demasiado grueso.

Cámara de deshidratación:

Tome una cápsula de Petri de 100 mm, poner una parte de un plato de 35 mm en el interior para hacer una "mesa" y añadir Drierite (sulfato de calcio anhidro) a su alrededor para que la altura de Drierite no es mayor que la "mesa" y la tapa. El cubreobjetos con embriones se colocan en esta "mesa" para la deshidratación antes de la inyección. Es una buena idea usar al menos algunas Drierite indicando el cambio y que cuando se ha cambiado de color.

Protocolo:

Este protocolo se puede utilizar para la inyección de casi cualquier reactivo soluble en el embrión de Drosophila sincitial: Por ejemplo, ya sea una proteína fluorescente para la observación o un inhibidor de la proteína diana o ambas cosas.

Preparando todo:

1 .- 2 a 3 días antes del experimento, hacer las placas de zumo de uva y establecer laicos jaula: Tome una botella de plástico (6 oz, de fondo redondo de Drosophila Científica Aplicada), corte dos agujeros pequeños (de 1 cm ²⁾ en los lados opuestos de la botella y rellenar con un trozo de algodón (esto permitirá que el aire circule), toque las moscas en la botella y la tapa con una placa de jugo de uva. Mantener a 25 ° C (o temperatura ambiente), las moscas deben establecer los embriones de unos 10 días.

2 .- Por lo menos un día antes del experimento de sacar las agujas para la inyección, se utiliza una aguja Kopf / pipeta modelo de extractor de 720 y delgados filamentos de vidrio de paredes (World Precision Instruments tw100f). Para la inyección de la tubulina fluorescente, mantenga agujas a 4 ° C para evitar que la temperatura inducida por polimerización en la aguja.

Tubulina preparación:

Nota: Todos los trabajos con la tubulina se debe hacer a 4 ° C para prevenir la polimerización.

1. Tome tubulina marcado fuera del congelador y ponerla en hielo durante 5 a 15 minutos.
2. Diluir con el G-PEM buffer (4 a 10 veces dependiendo de la intensidad requerida).
3. Se centrifuga a 13k rpm a 4 ° C durante 10-15 minutos.
4. Carga 1 a 2 l en la aguja.

Anticuerpos o inhibidores químicos:

Prepare agujas como para la tubulina, utilizando una concentración adecuada (esto puede ser necesario para ser probado). El anticuerpo puede ser en el buffer de la inyección, el G-PEM buffer o PBS. Si se necesita otro buffer, el buffer tendrá que ser inyectado como un control para asegurarse de que el buffer no causa ningún daño por sí mismo.

Nota: Inhibidor de la tubulina y fluorescentes se pueden mezclar e inyectar juntos si las concentraciones lo permiten. De lo contrario, inyectar la tubulina fluorescente y esperar de 5 a 10 minutos antes de la inyección del inhibidor. Cuando se realiza una doble inyección, empieza con más embriones, ya que menos embriones se recuperará con normalidad.

De recogida de embriones:

1. Ponga un plato de jugo de uva nuevo en la jaula estaba.
2. Eliminar esta placa después de una hora, esta es la primera colección del día y muchas veces no es muy buena. Puede ser descartada.
3. Cambiar la placa de cada hora para mantener la recogida de embriones durante una hora cada uno.

Cubreobjetos de preparación:

1. Ponga un cubreobjetos de 50 x 22 mm en un lado de un portaobjetos de microscopio. Cinta de las cuatro esquinas de la diapositiva para que no se mueve.
2. El uso de un aplicador con punta de algodón, poner una capa de pegamento heptano en una sola línea sobre el cubreobjetos (la cola no debe ser viscoso y se seca en pocos segundos, de lo contrario añadir más heptano).
3. Ponga un pedazo dedoble cinta adhesiva en la diapositiva hacia el lado del cubreobjetos.

Embrión de la preparación:

Nota: Los embriones deben ser reflejados de aproximadamente 2 horas después del inicio de la recolección, a fin de comenzar los siguientes pasos con tiempo suficiente para acabar con ellos dentro de este plazo.

1. Con una brocha humedecida cuidadosamente recoger los embriones de la placa de jugo de uva y el lugar en una cinta adhesiva doble en la diapositiva.
2. Utilizando la parte exterior de las pinzas, rollo de los embriones en la cinta adhesiva de doble hasta el corion (la membrana externa) se rompe.
3. Levante el embrión suavemente rodando sobre el corion por lo que se pega a la pinza y colocarlo en la cola de heptano en el cubreobjetos con el lado largo del paralelo de embriones para el lado largo del cubreobjetos. Conjunto entre un 10 y 20 embriones en una fila.
4. Quitar el cubreobjetos y colocarlo en la cámara de deshidratación de 3 a 8 minutos (esto depende de la humedad de la habitación y la cantidad a inyectar).
5. Colocar en una cámara de metal con grasa de vacío.
6. Cubrir los embriones con 700 halocarbonos aceite para evitar una mayor deshidratación. Los embriones están listos para la inyección.

Embrión de inyección:

1. Buscar los embriones en un objetivo de 16x.
2. Mueva los embriones de distancia, y encontrar la aguja sin moverse del plano focal.
3. Centro de la aguja y moverla hacia arriba sin moverlo en dirección xo y..
4. Si la aguja no está abierto, puesto al borde del cubreobjetos en el campo de visión, pero no cuando la aguja se va, y bajar la aguja con el mismo plano focal. Con mucho cuidado mover el cubreobjetos hasta que llega la aguja y con cuidado se rompe abierto. Si la aguja está abierto, vaya al paso 5. (Las agujas se pueden abrir con el ácido fluorhídrico antes del llenado).
5. Ponga los embriones a la vista (pero no en donde la aguja se), bajar la aguja en el aceite y asegúrese de obtener gotas de buen líquido de la aguja.
6. Con cuidado pero sin pausa mover el embrión en la aguja e inyectar una gota en el embrión y mover el embrión de distancia. (O siga las instrucciones de su aparato de inyección).
7. Después de todos los embriones se han inyectado, están listos para su observación en un microscopio confocal.

Imagen:

Imagen de los embriones en un microscopio confocal con un objetivo de 60 o 100 veces:
Notas:

1. El intervalo de tiempo en una serie lapso de tiempo debe ser como máximo de unos segundos, ya que la mitosis en el embrión es muy rápido, según el proceso exacto para ser estudiados.
2. Una serie en 3D o un solo plano, se pueden adquirir en función del proceso de interés.
3. De acción rápida inhibidores de la transferencia del microscopio de inyección de microscopio de imagen tiene que ser rápido.

Figura 1: Estudio de la mitosis en el embrión de Drosophila sincitial. Núcleos en el embrión temprano sufren divisiones rápida sin citocinesis, durante los ciclos de 10 a 13 núcleos forman una monocapa en la corteza. A. Esquemática del embrión temprano, con núcleos en la corteza. Embrión puede expresar las buenas prácticas agrarias y / o Solicitud de Propuestas proteínas marcadas y se pueden microinyección con otras proteínas marcadas y / o inhibidores. B. Tiempo de imágenes a intervalos de embriones que expresan GFP-tubulina y el PP-histonas. Parcela C de la separación de Polo-Polo de ciclos de 11 , 12 y 13 en un embrión de tipo silvestre. Longitud de husillo presenta períodos de duración isométrica y los períodos de elongación, que son muy consistentes y reproducibles. D. Dinámica de los microtúbulos del huso. La inyección de baja concentración de tubulina rodamina lleva a manchas formadas por una subunidades de tubulina pocos, que puede ser usado para estudiar la dinámica de los microtúbulos.

Discussion

Este protocolo es relativamente sencillo, sin embargo, cada paso requiere de práctica para asegurarse de que los embriones no están dañados. Cuidadosos experimentos de control siempre se necesita hacer para asegurar que los resultados se están obteniendo fiables. Una buena manera de comenzar es mediante la microinyección de tubulina buffer o rodamina en embriones de control que expresan GFP-tubulina para asegurarse de que la mitosis procede normalmente a través de todos los ciclos en la superficie del embrión (ciclos de 10 a 13). En los embriones de control no debe observar ninguna conexión física entre los ejes que a menudo son el resultado de la deshidratación excesiva, por lo que reducir el tiempo de deshidratación. Cuando los embriones son dañados, la lluvia radiactiva se observa a menudo, los centrosomas libre o espaciado desigual de los núcleos o ejes son indicativos de daño. Parcelas de distancia del poste-poste son muy reproducibles y son una medida muy fiable de "éxito", en los embriones de control que debe ser similar a los que se muestran en la figura 1.

Hemos utilizado este protocolo para estudiar muchos aspectos del conjunto de eje, el mantenimiento y la elongación con anticuerpos monoclonales, péptidos o policlonales frente a la proteína de interés ^{1,5,6,7,8,9,10,11,12,13.} Inhibidores específicos de la proteína u otras sustancias químicas que afectan a la proteína de interés también puede ser observado y microinyección de sus efectos y medir de manera cuantitativa. Para evaluar el efecto de un inhibidor de la particular, se compara la longitud del cabezal después de la inhibición a la observada en los embriones de control. También podemos observar la dinámica de la tubulina mediante el uso de fluorescentes Speckle Microscopía ¹⁴ después de la microinyección de una baja concentración de tubulina fluorescente (Fig. 1d).

Por lo general, cobrar por una hora y dejar que los embriones maduros para una hora más antes de la observación, esto significa que los embriones tienen entre 1 y 2 horas de vida cuando se observa. Si las moscas están sentando bien y muchos embriones son recogidos en una hora, entonces el tiempo de recogida se puede acortar de modo que más embriones de forma sincrónica, se obtienen dividiendo. Si el tiempo de inhibición es crítico o de interés para el estudio, el inhibidor puede ser inyectado bajo la observación confocal. Esto es más difícil, pero es posible, no obstante.