Summary
ووصف موت الخلايا المستندة للمقايسة الوكالة في محطات benthamiana نيكوتيانا.
Abstract
ينظرون إلى مسببات الأمراض المحتملة في بيئتهم ، واستخدام النباتات مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) موجودة على أغشية البلازما الخاصة بهم. PRRs الاعتراف ميزات الميكروبية الحفظ يسمى الممرض المرتبطة بأنماط الجزيئي (PAMPs) وهذا يؤدي إلى الكشف عن العوامل PAMP الحصانة (كونا) ، الذي يمنع بشكل فعال استعمار الأنسجة النباتية من غير مسببات 1،2. النظام الأكثر مدروسة في الوكالة هو السبيل 3 FLS2 المعتمدة. FLS2 تعترف flg22 PAMP الذي هو عنصر من عناصر فلاجيلين البكتيرية.
الممرضة الناجحة تمتلك عوامل الفوعة المستجيبات أو التي يمكن أن قمع الوكالة والسماح للالممرض لتسبب المرض 1. بعض النباتات بدورها تمتلك جينات المقاومة التي تكشف عن المستجيبات أو نشاطها ، مما يؤدي إلى تحفيز استخدام الحصانة المستجيب (ETI) 2.
وصفنا زنزانة المحكوم عليهم بالإعدام على أساس مقايسة للتعديل من الوكالة يا وCollmer 4. كانت موحدة في مقايسة N. benthamiana ، الذي يستخدم على نحو متزايد على نظام نموذجي لدراسة التفاعلات بين النبات والممرض 5. هي التي يسببها تسلل الوكالة لسلالة من البكتيريا المسببة للأمراض غير في الأوراق. سبع ساعات في وقت لاحق ، وهي السلالة البكتيرية التي تسبب المرض أو إما هو الذي ينشط ETI تسللت إلى منطقة تداخل المنطقة تسلل الأصلي. الوكالة الناجمة عن تسلل الأولى هي قادرة على تأخير أو منع ظهور موت الخلايا بسبب تسلل التحدي الثاني. على العكس ، وظهور موت الخلايا في منطقة تداخل التلقيح يدل على انهيار الوكالة.
وكانت أربع مجموعات مختلفة من المستحثات من الوكالة والتطعيمات التحدي موحدة (الجدول 1). تم اختبار الفحص على عدم إسكات N. benthamiana النباتات التي كانت بمثابة محطات مراقبة وإسكات للFLS2 التي يتوقع أن تتعرض للخطر في قدرتها على تطوير الوكالة.
Protocol
الجزء 1 : نمو النبات والصيانة
ينبغي نيكوتيانا benthamiana النباتات المستخدمة في فحص يكون حوالي 7 أسابيع من العمر. وينبغي تقليص أنهم على الأقل 4-5 أيام قبل الفحص لإزالة جميع فروع الإبطين والزهور. انها فكرة جيدة لإزالة فروع الإبطين بعد وقت قصير من ظهورها في النظام لجعل النباتات أكثر سهولة.
الجزء 2 : ثقافة البكتيرية
DAY 1 :
- وبدأت لوحات أو الثقافات عن كل السلالات المستخدمة في فحص في الوقت نفسه. لأنواع الزائفة. والتي تشمل 2 المستحثات وسلالات التحدي 3 ، والبكتيريا على لوحات متتالية KBM تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة من الأسهم المجمدة الجلسرين (الجدول 2). وينبغي نشر كمية صغيرة من البكتيريا في وسط اللوحة. احتضان لوحة على 30 درجة مئوية لعدة ساعات حوالي 18-24. لالأجرعية ، بدء ثقافة السائل في LB 2 مل من لوحة جديدة وتنمو بين عشية وضحاها في 250 دورة في الدقيقة ، 30 درجة مئوية.
يوم 2 :
- لالزائفة ، إضافة 150-200 KBM ميكرولتر من السائل إلى انتشار البكتيريا وتسليمهم لوحة بأكمله باستخدام نثر الزجاج العقيمة. وضع لوحة مرة أخرى في حاضنة وتركها تنمو لمدة ساعة 20-24. يجب أن يكون هناك حديقة البكتيرية على لوحة في اليوم التالي ، مشيرا إلى نمو جيدة. لالأجرعية ، بدء ثقافة الثانوي في حوالي 50-10 مل LB مع acetosyringone ميكرومتر 20 وتركها تنمو بين عشية وضحاها إلى 20 ساعة في 250 دورة في الدقيقة ، 30 درجة مئوية.
الجزء 3 : محطات الاستعداد للمقايسة
يوم 2 :
- قبل يوم واحد الفحص يجب أن يتم نقل النباتات إلى غرفة في 22-24 درجة مئوية ، ~ 35-40 ٪ RH الخفيفة والمستمرة.
- علامة الدوائر على الأوراق التي لا يقل عن 1.5 سم في القطر باستخدام علامة سميكة سوداء. يمكن أن تكون علامة سنتين إلى أربع دوائر لكل ورقة. وينبغي أن تكون دوائر متباعدة بشكل جيد ويفضل ألا عبر وريد كبير. اختيار جيد توسيع الأوراق. تجنب يترك كبار السن أو الأوراق التي هي صعبة أو سميكة لمسة وتجنب وضع علامات على الدوائر أقل أجزاء من ورقة.
الدوائر بمناسبة يوم قبل التجربة ليس من الضروري على البروتوكول. ومع ذلك ، فإنه يوفر الوقت إذا كانت هناك أعداد كبيرة من النباتات التي يعاير ، ويجعل من الاسهل لتحقيق توقيت دقيق بين الوكالة وتحريض التطعيمات التحدي.
الجزء 4 : تحريض الوكالة
اليوم 3 :
- حصاد الخلايا من لوحة في MgCl 10 مم 2 للالمتألقة وP. P. الكريهة. لالأجرعية ، ثقافة الطرد المركزي لجمع الخلايا وresuspend في MgCl 10MM 2 + 10 ملي MES الرقم الهيدروجيني 5.6. كرر الطرد المركزي وresuspend في حل 2 - MES MgCl. قياس الكثافة الضوئية (OD) من الخلايا في 600 نانومتر. ضبط المواد المستنفدة للأوزون القيم النهائي المطلوب كما هو موضح في الجدول رقم 2 ، وينبغي الزائفة معلق أخيرا في 10 ملي MgCl 2 و الأجرعية في حل 2 MgCl زارة التربية والعلم. وحدة تخزين ما مجموعه 25 مل يكفي لتلقيح 40-50 البقع.
- اختراق محرضات الوكالة في الاوساط قبل ملحوظ على الأوراق باستخدام حقنة 1 مل needleless. أكتب بالترتيب الذي كانت مخترقة من النباتات والوقت بالضبط عندما بدأ التسلل.
الجزء 5 : التلقيح التحدي
- إعداد P. syringae الكهروضوئية. DC3000 الطماطم ، PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 و PS الكهروضوئية الذبابة. لهذا التحدي كما هو موضح في الجدول جزءا 4.1 و 2.
- بعد سبع ساعات من تسلل محفز ، نفذ تسلل التحدي في نفس الترتيب من النباتات كما فعل الاستقراء. عموما ، يمكن استخدام نقطة على محيط الدائرة التلقيح الأولى بوصفها مركز الدائرة التلقيح الثانية. إذا كان هناك بقع متعددة على ورقة ثم تأكد من عدم تداخل عمليات التسلل.
- التخفيفات لوحة التسلسلي جميع الثقافات التي استخدمت في مقايسة على لوحات KBM LB أو التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة لتحديد العدد الدقيق CFU.
الجزء 6 : سجل للانهيار الوكالة
اليوم 5 :
- ابحث عن مظهر من موت الخلايا بسبب ETI في البقع التي تم الطعن مع DC3000 PST. موت الخلايا داخل المنطقة متداخلة من تسلل يشير إلى انهيار الوكالة ، وينبغي أن سجل باعتبارها النمط الظاهري إيجابية.
يوم 7 :
- ابحث عن مظهر من موت الخلايا بسبب المرض في المناطق التي تم الطعن مع توقيت المحيط الهادي DC3000 Δ hopQ1 PV - 1 أو فرع فلسطين. الذبابة
عند محطات مراقبة (التي لا ينبغي المساس عن كونا) تبدأ في إظهار موت الخلايا في منطقة تداخل عمليات التسلل ، ووقف اتخاذ أية ملاحظات أخرى.
الجزء 7 : النتائج الممثل
الشكل 1 يبين نتائج الفحص لحين P. وقد استخدم المتألقة كما محفز وDC3000 توقيت المحيط الهادي مثل التحدي.
الشكل 1. P. تم اختراق المتألقة على N. benthamiana يترك (دائرة سوداء) للحث على الوكالة و 7 ساعات في وقت لاحق ، وكان الطعن في البقعة مع DC3000 PST (دائرة بيضاء). وأظهرت محطات لإسكات FLS2 انهيار الوكالة في المنطقة ، حيث P. تم اختراق المتألقة (A) ، من وجهة نظر موت الخلية. وأظهرت محطات المراقبة التي لم تكن إسكات أي موت الخلايا في منطقة تداخل بسبب تحريض الوكالة (B). السهام الحمراء تشير إلى عدم وجود أو موت الخلايا في منطقة تداخل التسلل. وقد اتخذت صورا 2 بعد أيام من عمليات التسلل. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.
| الوكالة محفز | خلية الموت انتزاع التحدي | طبيعة موت الخلية | رمز |
| الزائفة المتألقة 55 | الزوائف syringae الكهروضوئية الطماطم (PST). DC3000 6 | ETI | ع ع / DC |
| P. الكريهة KT2440 | PST DC3000 | ETI | ص / DC |
| P. 55 المتألقة | PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 6 | مرض | Pf/Q1-1 |
| الأجرعية المورمة GV2260 | P. syringae الكهروضوئية. الذبابة 11528R | مرض | الزراعية / PTAB |
الجدول رقم 1 : مزيج من تحريض وكالة الانباء الخلية الموت استخلاص الميكروبات المستخدمة في فحص الخلية بالاعدام لكونا.
| سلالة بكتيرية | اختيار المتوسطة | استخدمت في التجربة النهائية OD | المقابلة CFU / مل |
| P. 55 المتألقة | KBM أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) | 0.5 | 1 × 10 9 |
| P. الكريهة KT2440 | KBM أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) | 0.5 | 1 × 10 8 |
| ألف المورمة GV2260 | LB ريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل) | 0.5 | 5 × 10 8 |
| PST DC3000 | KBM ريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل) | 0.02 | 2 × 10 7 |
| PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 | KBM ريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل) | 100 التخفيف من 0.1 أضعاف | 1 × 10 6 |
| P. syringae الكهروضوئية. الذبابة 11528R | KBM ريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل) | 100 التخفيف من 0.1 أضعاف | 1 × 10 6 |
الجدول 2 : شروط ومستويات الثقافة قيحة المستخدمة في الفحص. قد OD وما يقابلها من مستويات CFU تختلف بين ماركة مختلفة من الطيف.
Discussion
ويمكن استخدام الخلية مقايسة الموت القائم على تحديد تورط الجينات في الوكالة. على سبيل المثال ، يمكن اختبار الخسارة من وظيفة الجين المسوخ عن الاهتمام باستخدام هذا الاختبار. من أصل 4 من تركيبات محفز والتطعيمات التحدي الوارد في الجدول رقم 1 ، فمن الممكن أن تركيبة واحدة فقط قد يؤدي إلى النمط الظاهري في الخلفية محطة الخاص بك. وقد لاحظنا أن النباتات لإسكات FLS2 تظهر انهيار الوكالة في الجبهة الوطنية / DC Pf/Q1-1 وتركيبات من محفز والتطعيمات التحدي (الجدول 1).
فمن الضروري أن الظروف البيئية للمقايسة قريبة قدر الإمكان من تلك الموصوفة في الجزء 3.1. الرطوبة المنخفضة أسباب موت الخلايا والمضي قدما بسرعة كبيرة جدا ، مما يجعل من الصعب فحص درجة. إذا كانت الشروط الواردة في بروتوكول لدينا لا تعمل في المختبر الخاص بك ، ثم حاول تغيير مستوى محفز أو التلقيح التحدي. مقياس آخر يمكن تعديلها هي الفجوة الزمنية بين الاستقراء والتحدي ، على الرغم من أننا قد وجدت أن الفجوات الزمنية الأقصر تسببت في مقايسة لكسر بسرعة كبيرة جدا في محطات التحكم.
نوصي بأن ما لا يقل عن 4-5 نباتات يتم اختبارها في تجربة وينبغي تكرار النمط الظاهري إيجابية في تجارب مستقلة على الأقل 3-4.
Acknowledgments
نشكر هاي سوك أوه ، مريللو جوان ألن وCollmer ، قسم أمراض النبات وعلم الأحياء النباتية ، ميكروب ، جامعة كورنيل ، لإجراء مناقشات قيمة. نشكر جيسي Munkvold للتعليقات على هذه المادة. تم توفير التمويل من قبل البرنامج الوطني لمؤسسة العلوم النباتية الجينوم ، وعدد الجوائز DBI - 0605059 (GBM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. |
| Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | DU 730 |
References
- Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).
- Jones, J. D., Dangl, J. L.
- Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).
- Oh, H. S., Collmer, A. Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins. Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).
- Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana. Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).
