慢病毒生产

Summary

为了使慢病毒，DNA载体转染到人293细胞。收获后，集中上清液，荧光表达，流式细胞仪，是由病毒滴度。

Abstract

RNA干扰（RNAi）是在活细胞中的基因沉默系统。 RNA干扰，基因同源序列短干扰RNA（siRNA）的沉默转录后的状态。短发夹RNA的siRNA的前体，可使用慢病毒，允许在多种细胞类型中的RNAi表达。慢病毒，如人类免疫缺陷病毒，能够感染分裂和非分裂细胞。我们将描述一个程序包慢病毒。包装是指主管病毒DNA载体的准备。慢病毒载体的生产系统是基于一个“分裂”的制度，其中病毒的天然基因组已分割成单独的辅助质粒结构。这种不同的病毒分子分裂成4个独立的向量，减少不定的慢病毒基因组的重组创造了复制能力的病毒的风险。在这里，一个载体，利息和3个包装载体的shRNA（P - VSVG，PRSV，pMDL）瞬时转染到人293细胞。至少48小时的潜伏期后，病毒上清收获和集中。最后，记者（荧光灯）的表达，流式细胞仪，是由病毒滴度。

Protocol

第1部分：生产慢病毒转染的HEK 293细胞

* 24小时前转，板2.5 × 10 ⁶细胞在50-70％，第二天汇合10厘米菜。

1. 开始准备稍后会转染的细胞，使病毒的DNA与本议定书​​。首先，淡化FuGENE 6转染试剂罗氏公司，脂质体试剂，使细胞组成DNA。在1.5 ml管，移液器30μlFuGENE 6（SFDMEM）为600ul无血清培养基。小心不要让FuGENE触摸管方，因为它是进入中期交付。让这个FuGENE SFDMEM混合，在室温下孵育5分钟。
2. 管帽，混合4微克慢病毒质粒4微克每^第三代病毒包装载体（pMDL，PRSV和pVSV - G）。慢病毒载体包含病毒插入基因组的每一个细胞，它感染，而包装载体含有慢病毒所需的所有其他蛋白质的基因的DNA。
3. 关闭颠倒离心管几次的盖子，混合。
4. 在室温下孵育15-20分钟。
5. 到293盘管吸取的全部内容。通过倾斜板混合轻轻地来回。
6. 返回细胞的孵化器，并允许病毒生产继续在收获前48-96小时。
7. 孵化过程中，293细胞转录从慢病毒质粒DNA的利益，创造慢病毒构建的RNA副本。他们还抄写并翻译成病毒蛋白的包装载体的基因。这些蛋白质进行病毒含有RNA的版本，你慢病毒构建将反向转录病毒，它感染的所有细胞的基因组插入。

第2部分：慢病毒丰收

1. 潜伏期后，细胞外的孵化器，并使用一个一次性的，10ml注射器，去除上清，它现在包含病毒。将有大约上清10毫升。
2. 将一个0.45μm的注射器过滤器，尖和病毒过滤成贝克曼超速离心机管。过滤器只允许病毒和细胞通过。
3. 在丢弃之前，孵化所有病毒产生细胞培养板中，注射器和10％的漂白水45分钟的过滤器。

第3部分：通过慢病毒超速离心浓缩

1. SW - 41Ti或SW - 28转子水桶装入离心管。
2. 使用无血清DMEM，以平衡所有病毒含有管内0.2克。
3. 密封关闭转子桶和他们勾到转子前放置超速离心机转子
4. 超速离心机在90分钟的旋转病毒在4 ° SW - 41Ti转子在25000转或24000 SW - 28转子的转速C。
5. 在组织培养罩，反转管倒挂倒入一个含有10％的漂白粉的货柜上清。
6. 使用Kimwipe周围的颗粒吸收多余的液体和倒置在一个不超过五分钟，方便机架管。
7. 要重新挂起的病毒颗粒，使用一个过滤嘴管加入100μL无菌PBS，然后吸管向上和向下的20倍左右。
8. 保留病毒在4 ° C过夜完成重新悬浮。一个可以存放在4度，约1周，在-80度长达一年的病毒​​PREPS。请记住10％丢弃前漂白处理所有空管。
9. 如果打算使用超过1周的病毒的准备，为未来的实验和1 3等份滴定5μL，最小的5 -20μL等分。冻结和储存在零下80等份。

第4部分：用流式细胞仪的慢病毒滴定

1. 下一步是通过流式细胞仪来确定病毒滴度。这种方法只适用于在包含一个荧光报告基因的慢病毒载体。我们的想法是，当病毒感染细胞，它引入到该细胞的基因组慢病毒质粒DNA。被感染的细胞，然后将抄写和翻译的慢病毒载体的基因，包括，如果你包括一个荧光报告基因，感染的细胞会发出荧光。荧光水平的效用，或病毒滴度。
2. 对于每一个病毒的股票滴度，浓缩病毒液稀释成1.5毫升（DMEM培养液，钢笔链球菌，谷氨酰胺，FBS），完整的媒体。
3. 在1-6井在96孔板单列，执行以下的系列稀释：所有6个井加100μL完全DMEM媒体。第一添加媒体100μL无病毒（这是你的未染色的控制），第二孔加100μL稀释后的病毒（这相当于TO1毫升未经稀释的病毒），第三孔加100μL从第二口井的组合，第四以及100毫升，添加以及从第三至第五好添加100μL从4井，到第六孔加100μL从5井。最后采取100ul第六以及丢弃在漂白剂。串行稀释，每口井有一半的病毒量相比之前。
4. 带来的所有井的总体积为200μL。请注意，这些只是建议的稀释，这应该为滴定最集中的病毒。如果病毒滴度低，或花心，可能需要调整稀释。
5. 任何未使用的稀释病毒治疗丢弃前45分钟与10％的漂白水溅入一个生物危险废物的容器。
6. 6口井，每年新增〜15000健康，积极除以293细胞。一个单一的96孔板，可用于病毒滴度16 PREPS。
7. 返回细胞至37度的孵化器_，5％CO 2，并允许进行至少48小时的感染。
8. 潜伏期后，细胞对记者表达，流式细胞仪（在本例中荧光）分析。病毒颗粒定量％，每口井的荧光细胞。

用下面的公式计算出每毫升传染性单位：

_{（每口井每天感染X记者阳性细胞的细胞）×} 1000
^{______________________________________________________
载体毫升补充嘛}

第5部分：代表性的成果：

经过48小时的潜伏期后转染293细胞的板应在90％左右，荧光。一个荧光细胞的高比例是高比例的病毒产生细胞的迹象。

离心后，病毒颗粒resuspending时隐约可见。颗粒是明确的和非常小的，这是正常的的。

解释流式细胞仪检测结果时，请注意，只可以实现准确的效价计算，当受感染的细胞（日光灯）已经收到不超过每一个细胞病毒融合。为了确保这种情况下，使用细胞<15％计算感染率。细胞具有较高的感染率可能已经收到了每个单元的多个病毒integrants。在步骤2中建议的稀释应该产生这种感染的范围内的几个样本。理想的情况下，使用几个样本生成滴定曲线（线性），从中可以计算出最终的滴度，但你可以使用单个样本计算滴度，如有必要。可以预期，滴度为1.0 × ¹⁰ 7涂/毫升联合国浓缩病毒和1.0 × ¹⁰ 8恩/毫升浓缩病毒。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.