Lentivirus Productie

Summary

Te maken lentivirussen, zijn DNA-vectoren getransfecteerd in humane 293 cellen. Na de oogst en het concentreren van de supernatant, is virustiter bepaald door fluorescentie expressie met een flowcytometer.

Abstract

RNA-interferentie (RNAi) is een systeem van gene silencing in levende cellen. In RNAi, genen homoloog in volgorde om korte interfererende RNA (siRNA) worden monddood gemaakt bij de post-transcriptionele staat. Short hairpin RNA's, voorlopers van siRNA, kan worden uitgedrukt met behulp van lentivirus, waardoor RNAi in een verscheidenheid van celtypen. Lentivirussen, zoals het Human Immunodeficiency Virus, in staat zijn om infecteren zowel delende als niet-delende cellen. We beschrijven een procedure die tot pakket lentivirussen. Verpakkingen verwijst naar de voorbereiding van de bevoegde virus uit DNA vectoren. Lentivirale vector productie systemen zijn gebaseerd op een 'split' systeem, waar de natuurlijke virale genoom is opgesplitst in afzonderlijke helper plasmide constructen. Deze splitsing van de verschillende virale elementen in vier afzonderlijke vectoren vermindert het risico van een replicatie-capabele virus door toevallige recombinatie van de lentivirale genoom. Hier wordt een vector die de shRNA van rente en drie verpakkingen vectoren (p-VSVG, pRSV, pMDL) tijdelijk getransfecteerd in menselijke 293-cellen. Na ten minste een 48-uur incubatieperiode, is het virus bevat supernatant geoogst en geconcentreerd. Tot slot wordt virustiter bepaald door de verslaggever (TL), expressie met een flowcytometer.

Protocol

Deel 1: Transfectie van HEK 293 cellen te produceren Lentivirussen

* 24 uur voor transfectie, plaat 2,5 X 10 ⁶ cellen in een 10 cm schotel voor een confluentie van 50-70% de volgende dag.

1. Begin dit protocol door het opstellen van het DNA waarmee men later transfecteren een de cellen van het virus te maken. De eerste, verdunnen Fugene 6 transfectiereagens Roche, een lipide reagens die deel uitmaken cellen nemen DNA. In een 1,5 ml tube, pipet 30μl Fugene 6 in 600ul serum-vrij medium (SFDMEM). Wees voorzichtig niet te laten Fugene de zijkant van de buis zoals het wordt geleverd in het medium. Laat dit Fugene en SFDMEM mix en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
2. In de dop van de tube, mix 4 ug lentivirale plasmide met 4 mg elke 3 ^e generatie virale vectoren verpakking (pMDL, pRSV en pVSV-G). De lentivirale plasmide bevat het DNA van het virus zal voegen in het genoom van elke cel het infecteert, terwijl de verpakking vectoren bevatten genen voor alle andere eiwitten die nodig zijn om een ​​lentivirus te maken.
3. Sluit het deksel en meng door het buisje een paar keer.
4. Incubeer 15-20 minuten bij kamertemperatuur.
5. Pipet volledige inhoud van de tube in 293 plaat. Meng voorzichtig door het kantelen van plaat heen en weer.
6. Ga terug de cellen naar de incubator en laat virale productie voor 48-96 uur blijven voor de oogst.
7. Tijdens de incubatie, de 293-cellen transcriptie van het DNA van interesse van de lentivirale plasmide, het creëren van een RNA-kopie van de lentivirale bouwen. Ook transcriberen en vertalen van de genen in de verpakking vectoren in virale eiwitten. Deze eiwitten gaan naar virussen die de RNA-versie van uw lentivirale bouwen, dat het virus zal omkeren transcriberen en in te voegen in de genomen van alle cellen die het infecteert maken.

Deel 2: Lentivirale Harvest

1. Na de incubatieperiode, neem cellen uit de incubator en gebruik maken van een disposable, 10 ml injectiespuit op het supernatant, die nu het virus te verwijderen. Er zullen ongeveer 10 ml van het supernatant.
2. Bevestig een 0.45μM spuit filter om de tip en filter het virus in een Beekman Ultracentrifuge buis. Het filter laat alleen virussen, en niet cellen te passeren.
3. Voor weggooien, incubeer alle virus-producerende cellen, cultuur platen, spuiten en filters in 10% bleekwater voor 45 minuten.

Deel 3: Lentivirale Concentratie via Ultracentrifugatie

1. Laad centrifuge buizen in SW-41Ti of SW-28 rotor emmers.
2. Gebruik serum-vrij DMEM tot alle virus-bevattende balans buizen binnen 0.2g.
3. Seal gesloten rotor emmers en deze op de rotor haak voor het plaatsen van de rotor in de ultracentrifuge
4. Spin het virus gedurende 90 minuten in een ultracentrifuge bij 4 ° C bij 25.000 rpm in een SW-41Ti rotor of 24.000 rpm in een SW-28 rotor.
5. In een weefselkweek kap, omkeren buizen op zijn kop te supernatant giet het in een container met 10% bleekwater.
6. Gebruik een Kimwipe om overtollige vloeistof te absorberen om de pellet en de buis in een handig rek voor niet meer dan vijf minuten omkeren.
7. Om resuspendeer de virale pellet, gebruik maken van een filter tip om 100 pi steriel PBS toe te voegen aan de buis, dan pipet op en neer ongeveer 20 keer.
8. Laat het virus bij 4 ° C gedurende de nacht opnieuw ophanging te voltooien. Men kan opslaan virale preps bij 4 graden voor ongeveer 1 week en bij -80 graden tot maximaal een jaar. Vergeet niet om alle lege buizen te behandelen met 10% bleekmiddel voor weggooien.
9. Als men van plan om de virale prep gebruiken voor langer dan de 1 week, brengen minimale hoeveelheden van 5-20μl voor toekomstige experimenten en een hoeveelheid van 3 tot 5μl voor de titratie. Freeze en opslaan van de monsters bij min 80.

Deel 4: Lentivirale Titratie met gebruik van doorstroomcytometrie

1. De volgende stap is het bepalen van de virale titer door flowcytometrie. Deze methode werkt alleen in gevallen waarin de lentivirale plasmide bevat een fluorescerende reporter-gen. Het idee is dat wanneer het virus een cel infecteert, het de lentivirale plasmide DNA introduceert in het genoom van die cel. De geïnfecteerde cel zal dan transcriberen en vertalen van de genen die je hebt opgenomen in de lentivirale plasmide, en als je een tl-reporter-gen opgenomen, geïnfecteerde cellen zal fluoresceren. Het niveau van de fluorescentie vertegenwoordigt de potentie, of titer van het virus.
2. Voor elke virale voorraad worden getitreerd, verdunde 3 ui van geconcentreerde virus in 1,5 ml van complete media (DMEM, pen-strep, glutamine, FBS).
3. In putten 1-6 in een enkele rij van een 96 wells plaat, voert u de volgende seriële verdunningen: alle zes putten voeg 100 ul van complete DMEM media. Om de eerste goed 100μl van de media toe te voegen met geen virus (dit is uw onbesmet controle), de tweede goed 100 pi van de verdunde virus (dat is equivalent tot1 ml onverdunde virus), toe te voegen aan de derde en voeg 100 ulvan de mix van de tweede goed, de vierde en 100 ml toe te voegen van de 3e goed, op de vijfde goed 100μl uit de 4e goed, en tot de zesde goed toe te voegen Voeg 100 ul van de 5de goed. Eindelijk 100ul uit de 6e goed en gooi deze weg in het bleekmiddel. Een seriële verdunning werd uitgevoerd waarbij elk goed heeft helft van het volume van het virus in vergelijking met de vorige.
4. Breng het totale volume in alle putten 200μl. Merk op dat deze alleen gesuggereerd verdunningen, die goed zou moeten werken voor titering meest geconcentreerde virussen. Als het virus is laag in titer, of een ongeconcentreerde kan nodig zijn om de verdunningen aan te passen.
5. Behandel alle ongebruikte verdund virus met 10% bleekwater voor 45 minuten voor weggooien in een biologisch gevaarlijk afval container.
6. Voeg ~ 15.000 gezond, actief delende cellen 293 aan elk van de zes waterputten. Een 96-well plaat kan gebruikt worden om 16 virale preps titer.
7. Keer terug cellen tot 37 graden incubator met 5% CO ₂ en laat infectie te gaan voor minstens 48 uur.
8. Na de incubatie worden de cellen geanalyseerd op reporter expressie (in ons geval fluorescentie) met een flowcytometer. Virale deeltjes worden gekwantificeerd door het percentage van fluorescerende cellen per well.

Bereken het aantal infectieuze eenheden per ml met de volgende formule:

_{(# Cellen per putje op de dag van de infectie X verslaggever positieve cellen) X 1000}
^{______________________________________________________
ml van de vector toegevoegd aan goed}

Deel 5: representatieve resultaten:

Na een 48-uur incubatie periode na transfectie, moet de plaat van 293-cellen op ongeveer 90% TL. Een hoog percentage van de fluorescerende cellen is een indicatie van een hoog percentage van het virus producerende cellen.

Na het centrifugeren, de virale pellet is nauwelijks zichtbaar bij het mengen. Dit is normaal als de pellet is helder en zeer klein.

Bij de interpretatie van flowcytometer resultaten, er rekening mee dat men alleen kan nauwkeurige berekeningen titer te bereiken bij geïnfecteerd (tl-) cellen hebben ontvangen niet meer dan een virale integratie per cel. Om ervoor te zorgen dat dit het geval is, gebruik van cellen met <15% besmettingsgraad voor berekeningen. Cellen met een hoger infecties hebben ontvangen waarschijnlijk meerdere virale integranten per cel. De verdunningen gesuggereerd in stap 2 moet opleveren verschillende monsters binnen dit bereik van infectie. Idealiter maken gebruik van verschillende monsters een titratie plot (lineaire lijn) van waaruit u de uiteindelijke titer te berekenen te genereren, maar u kunt berekenen titer met een enkele steekproef, indien nodig. Men kan verwachten dat titer van 1,0 x 10 ⁷ TU / ml voor niet-geconcentreerde virus en 1,0 x 10 ⁸ TU / ml voor geconcentreerde virus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.