Lentivirus Produktion

Summary

Um Lentiviren, sind DNA-Vektoren in humanen 293-Zellen transfiziert. Nach der Ernte und die Konzentration der Überstand wird Virustiter mittels Fluoreszenz-Ausdruck mit einem Durchflußzytometer bestimmt.

Abstract

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein System von Gen-Silencing in lebenden Zellen. In RNAi, homologe Gene in der Reihenfolge auf short interfering RNAs (siRNA) sind in der post-transkriptionellen Staat zum Schweigen gebracht. Kurze Haarnadel-RNAs, Vorstufen von siRNA, kann mit Hilfe Lentivirus, so dass für RNAi in einer Vielzahl von Zelltypen werden. Lentiviren, wie das Human Immunodeficiency Virus, sind in der Lage zu infizieren sowohl teilende und nicht-teilenden Zellen. Wir beschreiben ein Verfahren, das zum Paket Lentiviren. Verpackung bezieht sich auf die Vorbereitung der zuständige Virus aus der DNA-Vektoren. Lentiviralen Vektor Produktion Systeme basieren auf einer 'split' System, wo die natürlichen viralen Genoms in einzelne Helfer Plasmid-Konstrukte wurde spaltet. Diese Aufspaltung der verschiedenen viralen Elementen in vier getrennten Vektoren vermindert die Gefahr der Schaffung von ein Replikations-fähig Virus durch zufällige Rekombination des lentiviralen Genoms. Hier sind ein Vektor, der die shRNA von Interesse und drei Verpackung Vektoren (p-VSVG, pRSV, pMDL) transient in humane 293-Zellen transfiziert. Nach mindestens einer 48-stündigen Inkubationszeit wird das Virus enthaltende Überstand geerntet und aufkonzentriert. Schließlich ist Virustiter von Reporter (fluoreszierend) Ausdruck mit einem Durchflußzytometer bestimmt.

Protocol

Teil 1: Transfektion von HEK 293 Zellen zu Lentiviren Produce

* 24 Stunden vor der Transfektion Platte 2,5 x 10 ⁶ Zellen in eine 10 cm Schüssel für eine Konfluenz von 50-70% am nächsten Tag.

1. Starten Sie dieses Protokoll durch die Vorbereitung der DNA, mit denen man später transfizieren wird man die Zellen auf Viren zu machen. Zuerst verdünnten FuGENE 6 Transfektionsreagenz Roche, ein Lipid-Reagenz, dass Zellen nehmen DNA zu machen. In einem 1,5 ml Röhrchen, Pipette 30μl FuGENE 6 in 600ul serum-freiem Medium (SFDMEM). Achten Sie darauf, nicht zulassen FuGENE Touch der Seite der Röhre, wie sie in das Medium abgegeben wird. Lassen Sie diese FuGENE und SFDMEM mischen und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
2. In die Kappe des Röhrchens mischen 4 ug lentiviralen Plasmid mit 4 g je 3 ^rd Generation viraler Vektoren Verpackung (pMDL, pRSV und pVSV-G). Die lentiviralen Plasmid enthält die DNA des Virus wird in das Genom jeder Zelle infiziert es einzufügen, während die Verpackung Vektoren Gene für alle anderen Proteine ​​benötigt, um ein Lentivirus make enthalten.
3. Schließen Sie den Deckel und mischen durch Invertieren des Röhrchens ein paar mal.
4. Inkubieren 15-20 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Pipette gesamte Inhalt des Röhrchens in 293 Teller. Vorsichtig mischen durch Kippen Platte hin und her.
6. Bringen Sie die Zellen in den Inkubator und ermöglichen virale Produktion für 48-96 Stunden vor der Ernte weiter.
7. Während der Inkubation transkribieren die 293-Zellen die DNA von Interesse aus der lentiviralen Plasmid, wodurch eine RNA-Kopie des lentiviralen konstruieren. Sie haben auch transkribieren und übersetzen die Gene in der Verpackung Vektoren in virale Proteine. Diese Proteine ​​gehen, um Viren, die die RNA-Version Ihres lentivirale Konstrukt, das das Virus übertragen umkehren wird und in das Genom aller Zellen, infiziert zu machen.

Teil 2: Lentivirale Ernte

1. Nach Inkubationszeit, nehmen Zellen aus dem Inkubator und mit einem Einweg-, 10ml Spritze mit dem Überstand, das nun den Virus zu entfernen. Es wird etwa 10 ml des Überstands werden.
2. Bringen Sie ein 0.45 Spritze Filter auf die Spitze und Filter des Virus in einer Beckman Ultrazentrifuge Röhre. Der Filter lässt nur Viren und nicht-Zellen passieren.
3. Vor dem Entsorgen, inkubieren alle Virus-produzierenden Zellen, Kultur-Platten, Spritzen und Filter in 10% Bleichmittel für 45 Minuten.

Teil 3: Lentivirale Konzentration über Ultrazentrifugation

1. Laden Zentrifugenröhrchen in SW-41Ti oder SW-28 Rotor Eimer.
2. Verwenden Sie serumfreiem DMEM für alle Virus-haltigen Gleichgewicht Rohre innerhalb 0.2g.
3. Seal geschlossen Laufschaufeln und Haken sie auf den Rotor, bevor Rotor im Inneren der Ultrazentrifuge
4. Spin des Virus für 90 Minuten in einer Ultrazentrifuge bei 4 ° C bei 25.000 rpm in einem SW-41Ti Rotor oder 24.000 rpm in einem SW-28 Rotor.
5. In einer Gewebekultur Kapuze, invertieren Röhrchen kopfüber an Überstand in einen Behälter mit 10% Bleichmittel gießen.
6. Verwenden Sie einen Kimwipe, um überschüssige Flüssigkeit rund um die Pellets zu absorbieren und das Röhrchen in eine bequeme Ablage für nicht mehr als fünf Minuten.
7. Zum erneuten Aussetzung der viralen Pellet, einen Filter verwenden, Spitze bis 100 ul sterilem PBS auf das Rohr hinzufügen, dann Pipette auf und ab etwa 20-mal.
8. Lassen Sie das Virus bei 4 ° C über Nacht Resuspension abzuschließen. Man kann virale preps bei 4 Grad lagern für ca. 1 Woche und bei -80 Grad bis zu einem Jahr. Denken Sie daran, alle leeren Tuben mit 10% Bleiche vor dem Wegwerfen zu behandeln.
9. Wenn man das virale prep länger als die 1 Woche nutzen will, um minimal Aliquots von 5-20 &mgr; l für zukünftige Experimente und 1 Aliquot von 3 bis 5μl für die Titration. Freeze und speichern Sie die Aliquots bei minus 80.

Teil 4: Lentivirale Titration mittels Durchflusszytometrie

1. Der nächste Schritt ist, um das virale Titer mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Diese Methode funktioniert nur in Fällen, in denen die lentiviralen Plasmid enthält einen fluoreszierenden Reporter-Gen. Die Idee ist, dass, wenn das Virus eine Zelle infiziert, es dem lentiviralen Plasmid-DNA führt in die Zelle das Genom. Die infizierte Zelle wird dann transkribieren und übersetzen die Gene die Sie in der lentiviralen Plasmid, und wenn Sie einen fluoreszierenden Reporter-Gen enthalten, infizierte Zellen fluoreszieren. Die Höhe der Fluoreszenz repräsentiert die Potenz oder Titer des Virus.
2. Für jeden viralen Bestand an titriert werden, verdünnte 3 ul konzentrierter Virus in 1,5 ml komplettem Medium (DMEM, Pen-Strep, Glutamin, FBS).
3. In Brunnen 1-6 in einer einzigen Zeile einer 96-Well-Platte, die folgenden Verdünnungsreihen: alle 6 Vertiefungen werden 100 ul von kompletten DMEM-Medien. Um die erste und fügen 100 &mgr; von Medien ohne Virus (dies Ihr ungefärbten Kontrolle), die zweite und mit 100 ul der verdünnten Virus (das entspricht to1 ml unverdünnter Virus), den dritten und mit 100 ulder Mischung aus der zweiten und zur vierten gut 100 ml ab dem 3. gut, in den fünften und fügen 100 &mgr; vom 4. gut, und die sechste und mit 100 ul aus dem 5. gut. Schließlich nehmen 100 ul aus dem 6. und und entsorgen in Bleichmittel. Eine Verdünnungsreihe wurde durchgeführt, wo jeder gut die Hälfte des Volumens des Virus im Vergleich zu dem davor.
4. Bringen Sie das Gesamtvolumen in alle Vertiefungen zu 200 ul. Beachten Sie, dass diese nur angedeutet Verdünnungen, die gut funktionieren sollte Titrierung konzentriertesten Viren sind. Wenn der Virus ist gering im Titer oder unkonzentriert, den Sie benötigen, um die Verdünnungen anzupassen.
5. Gönnen Sie unbenutzte verdünnten Virus mit 10% Bleichmittel für 45 Minuten vor dem Wegwerfen in eine biohazard Abfallbehälter.
6. Add ~ 15.000 gesunde, sich aktiv teilenden 293-Zellen zu jedem der 6 Vertiefungen. Ein einziger 96-Well-Platte kann auf 16 virale Titer preps werden.
7. Return-Zellen bis 37 Grad Inkubator mit 5% CO ₂ und damit Infektion für mindestens 48 Stunden vor.
8. Nach der Inkubation werden die Zellen für Reporter Ausdruck (in unserem Fall Fluoreszenz) mit einem Durchflußzytometer analysiert. Virale Partikel werden durch die Prozent der fluoreszierenden Zellen pro Vertiefung quantifiziert.

Berechnen Sie die Anzahl der infektiösen Einheiten pro ml nach folgender Formel:

_{(Anzahl der Zellen pro Vertiefung am Tag der Infektion X-Reporter positive Zellen) X 1000}
^{______________________________________________________
ml Vektor hinzugefügt, um auch}

Teil 5: Repräsentative Ergebnisse:

Nach einer 48-stündigen Inkubationszeit nach der Transfektion sollten die Platte von 293 Zellen bei etwa 90% fluoreszierende werden. Ein hoher Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen ist ein Hinweis auf einen hohen Anteil an Virus-produzierenden Zellen.

Nach Zentrifugation wird das virale Pellet kaum sichtbar, wenn Resuspendieren. Dies ist normal, da das Pellet ist klar und sehr klein.

Bei der Interpretation Durchflusszytometer Ergebnisse, beachten Sie, dass kann man nur erreichen, genaue Titer Berechnungen, wenn infizierte (Fluoreszenz)-Zellen haben nicht mehr als eine virale Integration pro Zelle aufgenommen. Um sicherzustellen, dass dies der Fall ist, verwenden Sie Zellen mit <15% Infektionsrate für die Berechnungen. Zellen mit höheren Infektionsraten wahrscheinlich mehrere virale Integranten pro Zelle aufgenommen. Die Verdünnungen in Schritt 2 vorgeschlagen sollten mehrere Proben in diesem Bereich der Infektion ergeben. Idealerweise sollten mehrere Proben auf eine Titration Grundstück (linear-Linie), von dem Sie das letzte Titer berechnen erzeugen können, aber Sie können Titer berechnen mit Hilfe einer einzigen Probe, wenn nötig. Man kann erwarten, Titer von 1,0 x 10 ⁷ TU / ml für un-konzentriert Virus und 1,0 x 10 ⁸ TU / ml für konzentriertes Virus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.