Biology

Lentivirus 제작

Published: October 2, 2009 doi: 10.3791/1499

¹Diabetes Center, University of California, San Francisco - UCSF

Summary

lentiviruses을 만들려면, DNA 벡터는 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 수확 후 뜨는을 집중, 바이러스 titer는 흐름 cytometer로 형광 표현식에 의해 결정됩니다.

Abstract

RNA 간섭 (RNAi)은 살아있는 세포에서 유전자 입을의 시스템입니다. RNAi에 유전자가 상동 짧은 간섭 RNAS을 순서대로 (siRNA) 포스트 transcriptional 상태에서 침묵하고 있습니다. 짧은 헤어핀 RNAS, siRNA에 엽 성의 전구 물질은 세포 유형의 다양한 RNAi 수있게 lentivirus을 사용하여 표현할 수있다. 같은 인간 면역 결핍 바이러스로 Lentiviruses는, 세포를 분리 및 비 분리를 모두 감염을 수 있습니다. 우리는 어떤 패키지 lentiviruses에 절차를 설명합니다. 포장은 DNA 벡터에서 관할 바이러스의 준비를 말합니다. Lentiviral 벡터 생산 시스템은 자연의 바이러스 게놈은 개인 도우미 플라스미드 구조로 분할되어 '분할'시스템을 기반으로합니다. 네 별도의 벡터로 다른 바이러스 요소의 분할은 lentiviral 게놈의 우발적인 재조합에 의한 복제 가능 바이러스를 생성의 위험을 감소. 여기, 관심을 세 포장 벡터의 shRNA (P - VSVG, pRSV, pMDL)를 포함하는 벡터가 transiently 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 최소한 48 시간 잠복기 후, 바이러스가 포함된 뜨는은 수확과 집중되어 있습니다. 마지막으로, 바이러스 titer는 기자 (형광) 흐름 cytometer와 표현에 의해 결정됩니다.

Protocol

1 부 : Lentiviruses 생산 HEK 293 세포의 Transfection

* 24시간 50~70% 다음날의 confluency에 10cm 접시에 transfection, 플레이트 2.5 X 10 ⁶ 세포 전에.

하나는 나중에 바이러스를 하나의 세포를 transfect 것입있는 DNA를 준비하여이 절차를 시작합니다. 첫째, FuGENE 6 Transfection 시약 로체, 세포가 DNA를 잡으 지질 시약을 희석. 1.5 ML 튜브에 피펫 30μl FuGENE 6 600ul 혈청없는 매체로 (SFDMEM). 그것이 매체에 전달로 FuGENE은 튜브의 측면을 건드리지 못하게하는주의하십시오. 이 FuGENE 5 분 실온에서 SFDMEM 믹스와 부화하자.
튜브의 뚜껑에서 4 μg 각 제 ^{3 세대} 바이러스성 포장 벡터 (pMDL, pRSV 및 pVSV - G)와 플라스미드 lentiviral 4 μg를 섞는다. lentiviral 플라스미드는 DNA 포장 벡터가 lentivirus하기 위해 필요한 다른 모든 단백질에 대한 유전자를 포함하는 동안 바이러스가, 그것이 감염 모든 세포의 게놈에 삽입됩니다 포함되어 있습니다.
반전 튜브 몇 배 뚜껑과 믹스를 닫습니다.
실온에서 15-20분을 품어.
293 판에 튜브의 피펫 전체 내용. 앞뒤로 기울이기 판으로 가볍게 섞는다.
인큐베이터에 세포를 반환하고 바이러스 생산 수확하기 전에 48~96시간 위해 계속하실 수 있습니다.
부화 기간 동안, 293 세포는 lentiviral 구조의 RNA 사본을 만드는, lentiviral 플라스미드에서 관심의 DNA를 고쳐 쓰다. 그들은 또한 녹음 및 바이러스 단백질로 포장 벡터의 유전자를 번역. 이 단백질은 바이러스가 녹음을 반대하고 감염의 모든 세포의 genomes에 삽입합니다 귀하의 lentiviral 구조의 RNA의 버전을 포함하는 바이러스를 만들기 위해 진행합니다.

2 부 : Lentiviral 하베스트

잠복기 후, 배양기의 세포를 가지고 이제 바이러스를 포함하는 표면에 뜨는를 제거하는 일회용, 10ml의 주사기를 사용합니다. 뜨는의 약 10ml있을 것입니다.
팁에 0.45μM 주사기 필터를 부착하고 베크맨 초원 심 분리기 튜브에 바이러스를 필터링합니다. 필터는 바이러스를 허용하고, 세포는 통과하지 않습니다.
폐기하기 전에 모든 바이러스 생산 세포를 품어, 문화 접시, 주사기 45 분 10 % 표백제에 필터.

파트 3 : Ultracentrifugation 통해 Lentiviral 농도

SW - 41Ti 또는 SW - 28 로터 버킷으로 원심 분리기 튜브를로드합니다.
모든 바이러스를 포함하는 균형을 0.2g 이내로 튜브를 혈청이없는 DMEM을 사용합니다.
초원 심 분리기 내부 회전자를 배치하기 전에 로터 양동이 안으로 들어가서 로터에 그들을 연결 인감
4 초원 심 분리기 90 분 동안 바이러스를 스핀 ° SW - 41Ti 로터에서 25,000 rpm 또는 SW - 28 로터에서 24,000 rpm으로 C.
조직 문화 후드에서 10 % 표백제가 들어있는 용기에 뜨는 잔을 거꾸로 튜브를 반전.
펠렛 주위에 여분의 액체를 흡수하고 5 분 더 이상 편리한 랙에 튜브를 반전하는 Kimwipe을 사용합니다.
바이러스 펠렛을 다시 중지하려면 20 시간을 아래 피펫 후, 튜브 100 μL 멸균 PBS를 추가하는 필터 팁을 사용합니다.
4 바이러스를 남겨 ° C 다시 중단을 완료 하룻밤. 하나는 약 1 주일 동안 최대 1 년 정도에 대해 -80 4 도에 바이러스 preps를 저장할 수 있습니다. 폐기하기 전에 10 %의 표백제 모든 빈 튜브를 치료해야합니다.
한 일주 이상에 대한 바이러스 준비를 사용하고자하는 경우, 적정에 대한 5μl 미래의 실험 3 1 나누어지는 5 - 20μl의 최소 aliquots합니다. 고정 및 마이너스 80 aliquots를 저장합니다.

4 부 : 유동세포계측법 사용 Lentiviral 적정

다음 단계는 유동세포계측법하여 바이러스 titer를 결정하는 것입니다. 이 방법은 lentiviral 플라스미드는 형광 리포터 유전자를 포함 경우에 작동합니다. 아이디어는 바이러스가 세포를 감염 때, 그 세포의 게놈에 lentiviral 플라스미드 DNA를 도입한다는 것입니다. 감염된 세포는 다음 녹음 및 lentiviral 플라스미드에 포함 유전자를 번역하고 형광 리포터 유전자를 포함하는 경우, 감염된 세포는 형광 것이다. 형광의 수준은 바이러스의 힘, 또는 titer를 나타냅니다.
각각의 바이러스 재고가 titered하기 위해서는, 전체 미디어 1.5 ML (DMEM, 펜 - strep, 글루타민, FBS)에 집중 바이러스 3 μl를 희석.
96 잘 접시의 단일 행에 우물 1-6에서는 다음과 같은 일련 dilutions을 수행 완료 DMEM 미디어 100 μl를 추가할 모든 6 웰스 수 있습니다. 좋지 100 μl를 추가합니다 물론 두 번째로 (이것은 당신의 흠없는 컨트롤)없이 바이러스와 미디어 100μl를 추가 세번째로 희석 바이러스 100 μl를 (undiluted 바이러스의 상당 to1 ML되는) 추가 먼저물론 두 번째의 혼합의, 잘 잘 다섯 번째로, 잘 3에서 100 ML을 추가할 잘 4 우물에서, 그리고 여섯 번째에 100μl를 추가합니다 물론 5에서 100 μl를 추가 네번째 수 있습니다. 마지막으로 6 자 밖으로 100ul을 가지고 표백제로 폐기. 각 물론 그 전에 한에 비해 바이러스의 절반 볼륨을 가지고 어디에 시리얼 희석이 수행되었다.
200μl의 모든 우물에서 전체 볼륨을 가져와. 이들이 가장 집중적으로 바이러스를 titering 위해 잘 작동해야만이 제안 dilutions,됩니다. 바이러스 titer에서 낮은, 또는 unconcentrated 경우 하나는 dilutions을 조정해야 할 수도 있습니다.
생물 학적 폐기물 용기에 폐기하기 전에 45 분 동안 10 % 표백제와 함께 사용하지 않은 희석 바이러스를 처리합니다.
6 우물 각 ~ 15,000 건강한 적극적으로 나누어 293 세포를 추가합니다. 단일 96 - 웰 플레이트는 16 바이러스 preps을 titer하는 데 사용할 수 있습니다.
5 % CO로 37 정도의 배양기에 세포를 반환 ₂ 감염이 최소 48 시간 동안 진행하실 수 있습니다.
부화 후, 세포는 흐름 cytometer와 함께 기자의 표현 (우리의 경우 형광의)에 대한 분석입니다. 바이러스성 입자가 잘마다 형광 세포의 퍼센트 quantitated 있습니다.

다음 수식과 ML 당 전염성 단위의 개수를 계산 :

_{(# 감염 X 기자 긍정적인 세포의 날에 잘 당 세포) X 1000}
^{______________________________________________________}
^{벡터의 ML이 잘 추가}

제 5 부 : 대표 결과 :

48 시간 잠복기 게시물 transfection 후, 293 세포의 플레이트는 90 % 정도 형광등에 있어야한다. 형광 세포의 비율이 높으면 바이러스 생산 세포의 높은 비율을 나타냅니다.

resuspending 때 원심 분리 후, 바이러스 펠렛 겨우 볼 수 있습니다. 펠렛은 투명하고 아주 작은므로 이것은 정상입니다.

세포 세포마다 한 병 이상은 안된다 바이러스 통합을받은 (형광) 감염 때 하나에만 정확한 titer 계산을 달성할 수있는 흐름 cytometer 결과를 해석, 적어 둡니다. 이 경우되도록하기 위해, 계산을위한 <15 % 감염 속도 세포를 사용합니다. 높은 감염률과 세포는 가능성이 세포마다 여러 바이러스 integrants을 받았습니다. 2 단계에서 제안 dilutions는 감염의 범위 내에서 몇 가지 샘플을 얻을 것입니다. 이상적으로, 당신이 마지막 titer를 계산 할 수있는 적정 계획 (선형 라인)을 생성하는 몇 가지 샘플을 사용하지만, 필요하다면 당신은 하나의 샘플을 사용하여 titer를 계산하실 수 있습니다. 하나는 기대할 수 titer 1.0 X 10 ⁷ TU / 취소 집중 바이러스 ML 및 1.0 X 10 ⁸ 농축 바이러스 TU / ML.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

샌들러 천식 기초 연구 센터 (세이버)
샌들러 재단

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO₂	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).