Summary
राइट - कोण माउस neocortex में डाला microprisms कई cortical परतों की एक आम तौर पर टुकड़ा में पाया दृष्टिकोण के साथ गहरी इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. एक मिलीमीटर microprisms एक विस्तृत क्षेत्र के दृश्य (~ 900 सुक्ष्ममापी) और स्थानिक वृक्ष के समान spines को हल करने के लिए पर्याप्त संकल्प प्रदान करते हैं. हम परत वी neuronal इमेजिंग और neocortical संवहनी microprisms का उपयोग इमेजिंग प्रदर्शित करता है.
Abstract
हम microprism के आकार में एक गहरी मस्तिष्क इमेजिंग जांच का उपयोग cortical ऊतक के vivo इमेजिंग में के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. Microprisms आकार में 1 मिमी हैं और उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश के आंतरिक प्रतिबिंब की अनुमति कर्ण पर एक चिंतनशील कोटिंग है. microprism जांच एक परिप्रेक्ष्य के साथ एक साथ कई cortical परतों छवियों को आमतौर पर केवल टुकड़ा तैयारी में देखा. छवियाँ के साथ एक बड़े एकत्र कर रहे हैं क्षेत्र देखने के (~ 900 सुक्ष्ममापी). इसके अलावा, हम गैर अस्तित्व शल्य प्रक्रिया पर विवरण और माइक्रोस्कोप सेटअप प्रदान करते हैं. प्रतिनिधि परिणाम तेरा-1 YFP - एच उनके शिखर dendrites सतही cortical परत के माध्यम से विस्तार और tufts में विस्तार दिखा चूहों से परत वी पिरामिड न्यूरॉन्स की छवियाँ शामिल हैं. संकल्प छवि परत वी न्यूरॉन्स के सोम के पास वृक्ष के समान spines के लिए पर्याप्त था. फ्लोरोसेंट डाई के इंजेक्शन पूंछ नस प्रांतस्था में रक्त वाहिकाओं के जटिल नेटवर्क से पता चलता है. लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) की capillaries के माध्यम से बह रेखा स्कैनिंग आरबीसी वेग और प्रवाह दरों को प्राप्त किया जा सकता है पता चलता है. इस उपन्यास microprism जांच एक सुरुचिपूर्ण, अभी तक शक्तिशाली गहरी सेलुलर संरचनाओं और vivo में cortical समारोह visualizing की नई विधि है.
Protocol
भाग 1: Microprism प्रकाशिकी और माइक्रोस्कोप सेटअप
- microprisms का उपयोग हम 1 मिमी, सही कोण prisms BK7 Optosigma निगम (चित्रा 1) से खरीदा कांच से बने हैं. Microprisms संदंश का उपयोग जब भी संभव नियंत्रित किया जाता है.
- microprism के कर्ण बढ़ाया चांदी के साथ लेपित है 400 से 97% से अधिक की एक प्रतिबिंब प्रदान - 2000 एनएम. यह दोनों लेजर उत्तेजना प्रकाश और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के आंतरिक प्रतिबिंब प्रदान करता है.
- Microprisms हमेशा संदंश का उपयोग संभव है जब नियंत्रित किया जाता है. दस्ताने हर समय पहने जाते हैं चश्मे को साफ रखने के.
- हम एक कस्टम निर्मित दो photon छोटे पशु इमेजिंग के लिए सक्षम माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. पशु, stereotactic डिवाइस से जुड़ी है, एक 3 अक्ष motorized मंच पर रखा गया है.
- खुर्दबीन ScanImage सॉफ्टवेयर चल रहा है एक Windows पीसी के लिए जुड़ा हुआ है. ScanImage छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर Pologruto एट अल 1 द्वारा Matlab में लिखा है.
- Microprism इमेजिंग के लिए, हम 1024 x 1024 या 512 x 512 पिक्सल के एक संकल्प के पर छवियों को इकट्ठा. इसके अलावा, हम आम तौर पर 2 एमएस लाइन / या 4 / एमएस लाइन पर स्कैन.
- उद्देश्यों की दो प्रकार के प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है:
- एक कम संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के विस्तृत क्षेत्र के दृश्य इमेजिंग के लिए हवा उद्देश्य (अभिकर्मकों और उपकरण की तालिका देखें) .
- एक गिलास सुधार द्वारा प्रेरित 0 गोलाकार aberrations के कम से कम करने में सक्षम कॉलर के साथ एक उच्च एनए हवा उद्देश्य - कांच के 2 मिमी (अभिकर्मकों और उपकरण की तालिका देखें) .
- जब जानवर एक कम बढ़ाई उद्देश्य के तहत इमेजिंग के लिए तैयार है, microprism के शीर्ष के साथ लेजर के वर्ग रेखापुंज पैटर्न स्कैनिंग संरेखित करें. यह उन्मुख छवि मदद मिलेगी और लेजर शक्ति के कुशल उपयोग करें.
- एक गिलास सुधार कॉलर के साथ एक उच्च एनए उद्देश्य का प्रयोग, सुधार कॉलर सेट करने के लिए कांच के लगभग 1 मिमी के लिए सही है. एक बार छवि एक फ्लोरोसेंट प्रयोग के दौरान दिखाई देता है, एक ध्यान से खुर्दबीन अंदर तक पहुँचने के लिए सुधार कॉलर का अनुकूलन करने के लिए संकल्प इमेजिंग को अधिकतम कर सकते हैं.
भाग 2: गैर अस्तित्व पशु सर्जरी और Microprism घुसाव
- पूरी प्रक्रिया की लंबाई, प्रारंभिक चीरा से इमेजिंग के पूरा होने तक प्रयोग के उद्देश्यों पर निर्भर करता है. 40 मिनट के लिए पूरा - हालांकि, गैर अस्तित्व शल्य प्रक्रिया और microprism प्लेसमेंट ले लगभग 30 की उम्मीद किया जा सकता है.
- चूहे (p30-P60) तौला और anesthetized उचित शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं के लिए उपयुक्त विमान ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किलो) की एक आईपी इंजेक्शन का उपयोग कर रहे हैं.
- पूरे प्रयोग के दौरान, जानवर संज्ञाहरण के स्तर का आकलन करने के लिए हर 15-20 मिनट की जाँच की जानी चाहिए. यदि पशु के प्रति प्रतिक्रिया करता है एक फर्म पैर के अंगूठे चुटकी, ketamine / xylazine के एक पूरक खुराक की आवश्यकता है. आमतौर पर एक पूरक खुराक प्रारंभिक खुराक की एक तिहाई है और तत्काल आईपी इंजेक्शन के लिए एक सिरिंज में समय से आगे तैयार किया जा सकता है अगर जरूरत है.
- एक बार ठीक anesthetized माउस है, जानवर के सिर पर बालों के बहुमत एक # 40 ब्लेड के साथ एक trimmer का उपयोग बंद मुंडा है.
- नायर ® कि बाल इमेजिंग microprism के दौरान रास्ते में मिल सकता है की एक मुक्त सतह बनाने में मदद करने के लिए सिर पर बाल शेष के लिए लागू किया जाता है. 5 मिनट के बाद, नायर ® से साफ किया जाता है एक कपास झाड़ू से साफ़ करना इत्तला दे दी का उपयोग.
- anesthetized जानवरों की ठीक से एक माउस stereotactic डिवाइस में रखा गया है. पशु शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और इमेजिंग सत्र के दौरान एक पानी से भरे हीटिंग पैड 36 डिग्री सेल्सियस पर सेट पर रखा है.
- ठीक से जगह में तय जानवर सिर के साथ, एक साफ चीरा खोपड़ी के औसत दर्जे लाइन के नीचे एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए त्वचा को अलग किया जाता है.
- 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड की एक छोटी राशि एक कपास इत्तला दे दी झाड़ू पर रखा गया है और को दूर खोपड़ी और त्वचा के बीच झिल्ली स्पष्ट खोपड़ी के लिए आवेदन किया.
- हाइड्रोजन पेरोक्साइड भी bregma, जहां craniotomy प्रदर्शन करने के लिए और microprism सम्मिलित जानने में एक प्रमुख मील का पत्थर प्रकट करने में मदद करता है.
- इससे पहले craniotomy शुरू कर दिया है, कान सलाखों और काटने बार ठीक से उजागर ऐसी है कि यह मूल रूप से तालिका के साथ स्तर है खोपड़ी झुकाव के लिए समायोजित कर रहे हैं. यह craniotomy के लिए एक बेहतर मंच प्रदान करता है. इसके अलावा, यह आने वाली उत्तेजना प्रकाश के साथ चश्मे सीधा के ऊपर की सतह बनाता है. यह इमेजिंग जबकि ऑप्टिकल aberrations कम से कम करने में मदद करेगा.
- एक छोटी सी दंत गड़गड़ाहट (~ 0.8 मिमी सिर के आकार) एक Dremel ® उपकरण एक लचीला एक्सटेंशन हाथ का उपयोग करने के लिए जुड़ा हुआ है. Craniotomies के लिए, हम लगभग 7,000 से 10,000 rpms के लिए गति सेट.
- दंत गड़गड़ाहट खोपड़ी साथ स्किम्ड है जब तक एक वर्ग नाली हड्डी में स्थापित है. वर्ग के पक्ष लंबाई में लगभग 2-3 मिमी और 1.5 मिमी दुम और 1 मिमी bregma करने के लिए पार्श्व केन्द्रित.
- सतत thinning हड्डी है जब तक कि एक छोटे से खोलने खोपड़ी के माध्यम से किया जाता है. संदंश ca की एक जोड़ीn हड्डी खोपड़ी से दूर प्रालंब लिफ्ट.
- dura पहले microprism प्रांतस्था में डाला जा सकता हटाया जा जरूरत है. रक्तस्राव सबसे अच्छा दे कई मिनट के लिए सतह पर रक्त जमना द्वारा नियंत्रित किया जाता है. बाद में, coagulated खून microprism डालने से पहले एक शल्य स्पंज का उपयोग कर निकाल दिया जाता है.
- प्रांतस्था के साथ चश्मे के संरेखण की सहायता में मदद करने के लिए, microprism के ऊर्ध्वाधर चेहरा पंक्तिवाला है समानांतर संदंश पर हैंडल.
- ठीक से आयोजित चश्मे के साथ, पूरे microprism चश्मे के शीर्ष तक neocortical सतह के साथ भरा है डाला जाता है.
- जब सही ढंग से डाला, microprism उचित स्थिति में रहना चाहिए. किसी भी खून बह रहा है कि परिणाम कम है और एक छोटी सी शल्य स्पंज के साथ अवशोषित किया जा सकता है. एक बार चश्मे की जगह में है पशु इमेजिंग के लिए तैयार है.
- एक microprism के बाद एक जानवर में इस्तेमाल किया गया, यह किया जा सकता है कई बार फिर से इस्तेमाल किया. हालांकि, यह ठीक करने के लिए किसी भी शेष जैविक सामग्री हटाने के लिए साफ होने की जरूरत है. यह एचसीएल एसिड, मेथनॉल में एक डुबकी के द्वारा पीछा के एक छोटी मात्रा में चश्मे की सूई के द्वारा पूरा किया जा सकता है. साफ microprism तो भविष्य के उपयोग तक लेंस कागज में लपेटा जा सकता है है.
भाग 3: प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1: सही कोण microprism की छवियाँ. इस प्रयोग में प्रयुक्त एक मिलीमीटर prisms, उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश के आंतरिक प्रतिबिंब की अनुमति कर्ण पर एक बढ़ाया चांदी कोटिंग के साथ BK7 कांच prisms हैं.
चित्रा 2: परत वी YFP पिरामिड न्यूरॉन्स की छवि. 900 cortical सतह से गहरे सुक्ष्ममापी - microprism क्षेत्र के दृश्य के साथ वाइड इमेजिंग पिरामिड सेल ~ 800 निकायों की एक बड़ी आबादी से पता चलता है. इसके अलावा, शिखर dendrites परत की ओर विस्तार के अनुसार, मैं भी हल किया जा सकता है. स्केल बार = 200 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3: एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य microprism स्थानिक संकल्प प्रदान करता है परत वी पिरामिड न्यूरॉन्स पर शिखर dendrites पर वृक्ष के समान spines को हल करने के लिए पर्याप्त के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया. स्केल बार = 10 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 4: एक छवि प्राप्त microprism और पूंछ नस फ्लोरोसेंट डाई के इंजेक्शन का उपयोग . छवि ऊर्ध्वाधर, बड़े कैलिबर जहाजों गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों और छोटे capillaries के cortical मात्रा के माध्यम से शाखाओं में बंटी से देने से पता चलता है. स्केल बार = 200 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 5: एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य का प्रयोग, neocortex में capillaries के नेटवर्क के अधिक से अधिक विस्तार के साथ imaged किया जा सकता है. स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 6: Microprisms भी इमेजिंग लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) की वाहिकाओं के माध्यम से बह के लिए अनुमति देता है. लाल रक्त कोशिकाओं फ्लोरोसेंट डाई को अवशोषित नहीं है और इसलिए कर रहे हैं पोत भर अंधेरे धारियों के रूप में देखा. पोत भर लाइन स्कैनिंग करके, एक आरबीसी प्रवाह और वेग की माप प्राप्त कर सकते हैं. स्केल बार = 10 (ऊपर और नीचे छवि में क्षैतिज पट्टी) सुक्ष्ममापी और एमएस 250 (नीचे छवि में अनुलंब पट्टी).
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Discussion
एक इमेजिंग प्रयोग में एक microprism का उपयोग अपेक्षाकृत सरल है और neocortex पर vivo अध्ययन में लिए कई लाभ प्रदान करता है है. प्रतिनिधि इस तकनीक का उपयोग कर उदाहरण परत वी cortical न्यूरॉन्स में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों से ली गई है छवियों में शामिल हैं. Microprisms का उपयोग एक बड़े परत वी में पिरामिड सेल शरीर, cortical सतह के नीचे लगभग 1 मिमी का एक संग्रह देख सकते हैं. भी देखा कि tufts (चित्रा 2) में diverging पहले सतही सभी परतों के माध्यम से विस्तार शिखर dendrites. इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल चूहों में ही परत वी न्यूरॉन्स (YFP - एच 2) YFP व्यक्त करने के लिए डिज़ाइन ट्रांसजेनिक जानवर हैं. इन YFP - एच चूहों और एक गिलास सुधार कॉलर के साथ एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य का प्रयोग यह भी संभव है और अधिक विस्तार के साथ dendrites छवि वृक्ष के समान spines (चित्रा 3) को सुलझाने.
एक भी fluorescein-dextran स्थापित पूंछ नस इंजेक्शन तकनीक का उपयोग कर के रूप में एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ cortical रक्त वाहिकाओं लेबल कर सकते हैं. आमतौर पर वयस्क चूहों के लिए 20 मिलीग्राम / शारीरिक खारा में मिलीलीटर 100 उल fluorescein-dextran की सांस में इंजेक्शन उपयुक्त है. सबसे अच्छा परिणाम डाई इंजेक्शन से आते बाद microprism neocortex में डाला गया है (2.16 कदम के बाद). इस तकनीक का उपयोग एक बड़ा गहरी परतों से कैलिबर जहाजों पिया की ओर विस्तार और बंद शाखाओं में बंटी microcapillaries के नेटवर्क (चित्रा 4) के रूप में देख सकते हैं. Neocortex में यह microcapillaries के जटिल नेटवर्क का सबसे अच्छा एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य (चित्रा 5) का उपयोग करने के लिए सराहना की है.
इसके अलावा, यह संभव है गहरी neocortical capillaries से लाइन स्कैनिंग द्वारा एक पोत (6 चित्रा, शीर्ष छवि में लाल रेखा) की लंबाई के साथ लाल रक्त कोशिका वेग और प्रवाह को मापने. के बाद से लाल रक्त कोशिकाओं फ्लोरोसेंट डाई नहीं लेते, वे अंधेरे धारियाँ के रूप में दिखाई देगा. छवियाँ है कि एक पंक्ति स्कैन से परिणाम एक अक्षों में एक स्थानिक आयाम और अन्य अक्षों में एक अस्थायी आयाम (चित्रा 6, नीचे छवि) है. इन छवियों से, एक केशिका के माध्यम से प्रवाह और लाल रक्त कोशिकाओं के वेग की गणना कर सकते हैं. 6 आंकड़ा के मामले में, आरबीसी प्रवाह 36 लाल रक्त कोशिकाओं / 0.45 मिमी / सेकंड के एक वेग के साथ दूसरा मापा गया था. यह 3 साहित्य से परिणामों के साथ समझौते में है .
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Disclosures
जानवरों पर प्रयोगों येल विश्वविद्यालय IACUC द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
हम YFP चूहों प्रदान करने के लिए एंथनी जे Koleske, पीएचडी धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| With enhanced silver reflective coating-(R77) | OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA) | 055-0010 | With enhanced silver reflective coating-(R77) |
| Fluorescein-dextran | Sigma-Aldrich | FD70 | 70 kDa |
| 0.28 NA, 4x air objective | Olympus Corporation | XLFLUOR 4x/340 | |
| 0.60 NA, 40x air objective | Olympus Corporation | LUCPLFLN | With 0-2 mm coverglass correction |
References
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).
