Summary
마우스를 네크로 텍스에 삽입 마우스 오른쪽 단추로 각도 마이크로 일반적으로 통에 발견 관점 여러 피질 레이어의 깊은 화상을 허용합니다. 원 - mm 마이크로는 다양한 현장의 전망 (~ 900 μm의)와 돌기 쪽이를 해결하기 위해 충분한 공간 해상도를 제공합니다. 우리는 계층 V의 연결 이미지와 마이크로를 사용하여 neocortical 혈관 영상을 보여줍니다.
Abstract
우리는 microprism 모양의 깊은 두뇌 이미징 프로브를 사용하여 대뇌 피질의 조직의 생체내 이미징에 대한 프로토콜을 제시한다. 마이크로의 크기는 1 mm이며, 여기 및 방출 빛의 내부 반사를 허용하도록 hypotenuse에 반사 코팅 있습니다. 관점 microprism 프로브가 동시에 이미지를 여러 피질 층은 일반적으로 전용 슬라이스 준비 모습. 이미지가 크고 회수 필드 -보기 (~ 900 μm의). 또한, 우리는 아닌 생존 수술에 대한 자세한 내용 및 현미경 설정을 제공합니다. 대표 결과는 표면 피질 층을 통해 확장하고 플로팅에 걸쳐 자신의 혀끝의 dendrites를 보여주는 뜻이 - 1 YFP - H 마우스에서 레이어 V 피라미드의 뉴런의 이미지가 포함되어 있습니다. 해상도 계층 V의 뉴런의 소마 근처 이미지 돌기의 쪽이하기에 충분했다. 형광 염료의 꼬리 - 정맥 주입은 피질의 혈관의 복잡한 네트워크를 보여줍니다. 모세 혈관을 통해 흐르는 적혈구 (RBCs)의 라인 스캔은 RBC 속도 및 유량 속도를 얻을 수를 보여줍니다. 이 소설 microprism 프로브 깊은 세포 구조와 생체내에서 대뇌 피질의 기능을 시각화의 우아한 아직 강력한 새로운 방법입니다.
Protocol
1 부 : Microprism의 광학 현미경 설정
- 우리가 사용하는 마이크로는 Optosigma 공사 (그림 1)에서 구입한 BK7 유리로 만든 1 mm, 오른쪽 - 각도 프리즘입니다. 마이크로가 가능한 집게를 사용하여 처리됩니다.
- 2,000 NM - microprism의 hypotenuse 400에서 이상 97%의 반사율을 제공하기 위해 향상된 은으로 코팅됩니다. 이것은 레이저 여기 광과 형광 방출 모두의 내부 반사를 제공합니다.
- 마이크로 항상 가능하면 집게를 사용하여 처리됩니다. 장갑은 프리즘을 더럽히지 않으 항상 착용하고 있습니다.
- 우리는 작은 동물 이미징 수있는 맞춤식 두 광자 현미경을 사용합니다. stereotactic 장치에 부착된 동물은, 3 축 전동 무대에서 배치됩니다.
- 현미경은 ScanImage 소프트웨어를 실행하는 윈도우 PC에 연결됩니다. ScanImage는 Pologruto 외 1 Matlab로 작성된 이미지 수집 소프트웨어입니다.
- microprism 이미징 위해, 우리는 1024 X 1024 512 X 512 픽셀의 해상도로 이미지를 수집합니다. 또한, 우리는 일반적으로 2 MS / 라인 또는 4 MS / 라인에서 스캔.
- 목표의 두 가지 유형이 실험에서 사용됩니다 :
- 다양한 뷰 필드 이미징을위한 낮은 수치 구경 (NA) 공기 목적 (시약 및 장비의 표 참조).
- 0 유발 구형 aberrations을 최소화 수있는 유리 보정 칼라와 높은 NA 공기 목적 - 유리 2mm (시약 및 장비의 표 참조).
- 동물이 낮은 배율 목적에 따라 이미징을위한 준비가되면, microprism 상단으로 레이저의 제곱 래스터 스캐닝 패턴을 맞춥니다. 이것은 동양에게 이미지를 도움 레이저 파워를 효율적으로 사용할 수 있도록합니다.
- 유리 보정 칼라와 높은 NA의 목표를 사용하여 유리의 약 1mm에 대한 해결하기 위해 보정 칼라를 설정합니다. 형광 이미지가 실험 도중 나타나면, 하나주의 깊게 이미지 해상도를 극대화하기 위해 보정 칼라를 최적화하기 위해 현미경 내부에 도달할 수 있습니다.
2 부 : 비 생존 동물 수술과 Microprism 삽입
- 전체 프로 시저의 길이는 초기 절개에서 이미지의 완성까지, 실험의 목표에 따라 달라집니다. 완료 40 분 - 그러나, 이외의 생존 수술과 microprism 게재는 약 30을 기대하실 수 있습니다.
- 마우스 (P30 - P60)은 무게가 있고 anesthetized 적절하게 수술 절차에 적합 비행기에 마취제 (100 MG / kg)과 xylazine (10 MG / kg)의 IP 주사를 사용합니다.
- 전체 실험을하는 동안, 동물은 마취 자사의 수준을 평가하기위한 모든 15~20분을 확인하여야한다. 동물에 반응하는 경우 회사 발가락 - 찔러봐, 마취제 / xylazine의 추가 복용이 필요합니다. 일반적으로 보완 복용량은 초기 복용량의 1 세번째이며 필요한 경우 즉각적인 IP 주사 주사기에 미리 준비하실 수 있습니다.
- 마우스가 제대로 anesthetized되면, 동물의 머리에있는 머리카락의 대부분은 # 40 블레이드와 트리머를 사용하여 해제 면도 있습니다.
- 나이르 ®은 이미징 동안 microprism의 방법으로 얻을 수 머리카락 무료로 표면을 만들 수 있도록 머리에 남아있는 머리카락이 적용됩니다. 5 분 후에, 나이르 ®은 목화 - 스쳐 면봉을 사용하여 닦아입니다.
- anesthetized 동물이 제대로 마우스 stereotactic 장치에 배치됩니다. 수술 절차 및 이미징 세션 동안 동물은 섭씨 36 도에 설정 물이 채워진 가열 패드에 보관됩니다.
- 제대로 자리에 고정 동물의 머리를 한 깨끗한 절개는 피부를 분리 두개골의 중간 라인 아래 메스를 사용하여 이루어집니다.
- 3 % 과산화수소의 소량은 목화 - 스쳐 면봉에 위치하고 두개골과 피부 사이의 세포막을 치워로 두개골에 적용됩니다.
- 과산화수소는 bregma, craniotomy을 수행하고 microprism를 삽입할 위치를 파악하는 주요 랜드마크를 공개하는 데 도움이됩니다.
- craniotomy이 시작되기 전에, 귀 바, 물린 표시줄이 올바르게 그것은 테이블과 기본적으로 수준 그러한 노출된 두개골을 기울 조정됩니다. 이것은 craniotomy을위한 더 나은 플랫폼을 제공합니다. 또한, 이것은 들어오는 여기 빛이 프리즘 직각의 상단 표면을합니다. 이것은 이미징하는 동안 광학 aberrations을 최소화하는 데 도움이됩니다.
- 작은 치과 버는 (~ 0.8 mm의 머리 크기) 유연한 확장 팔을 사용하여 Dremel ® 도구에 연결되어 있습니다. craniotomies 위해, 우리는 약 7,000 만 RPM으로하는 속도를 설정합니다.
- 광장 홈이 뼈 설립 때까지 치과 버는 두개골을 따라 미끄러져입니다. 광장의 양쪽 길이가 약 2~3mm하고 1.5 mm의 꼬리와 bregma하는 측면 1mm를 중심으로.
- 작은 오프닝이 두개골을 통해 만들어진 때까지 뼈를 벗겨 계속. 포셉 CA의 쌍N 떨어져 두개골의 뼈 떼어 리프트.
- 두라는 microprism가 피질에 삽입하기 전에 삭제해야합니다. 출혈이 가장 피가 몇 분 동안 표면에 응고시키는에 의해 제어됩니다. 그 후, coagulated 혈액은 microprism를 삽입하기 전에 수술 스폰지를 사용하여 제거됩니다.
- 피질과 프리즘의 정렬을 지원하기 위해, microprism의 수직 얼굴 포셉의 처리에 평행하게 줄지어있다.
- 프리즘의 상단이 neocortical 표면 플러시 때까지 제대로 개최 프리즘으로 전체 microprism가 삽입됩니다.
- 제대로 삽입되면, microprism는 적절한 위치에 유지됩니다. 그 결과 모든 출혈이 최소화되고 작은 수술 스펀지로 흡수 수 있습니다. 프리즘은 장소에 일단 동물 이미징을위한 준비가 된 것입니다.
- microprism가 동물에 사용되고 나면, 그것은 여러 번 다시 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 제대로 남아있는 생물 학적 물질을 제거하는 청소해야 없습니다. 이것은 메탄올에 물놀이 다음 HCL 산의 작은 볼륨으로 프리즘 디핑하여 수행할 수 있습니다. 청소 microprism 그런 다음 나중에 사용하기 전까지는 렌즈 종이에 싸서 수 있습니다.
파트 3 : 대표 결과
그림 1 : 오른쪽 앵글 microprism 이미지. 본 실험에 사용되는 프리즘은 여기 및 방출 빛의 내부 반사를 허용하도록 hypotenuse에 고급 실버 코팅 한 mm, BK7 유리 프리즘입니다.
그림 2 : 레이어 V YFP 피라미드의 뉴런 이미지. 대뇌 피질의 표면에서 깊이 900 μm의 - microprism과 함께 다양한 현장의 뷰 영상은 피라미드 세포 기관 ~ 800의 큰 인구를 보여줍니다. 또한, 계층으로까지 확대 혀끝의 dendrites는 I도 해결할 수 있습니다. 스케일 바 = 200 μm의.
그림 3 : microprism 공간적 해상도 레이어 V 피라미드의 뉴런에 혀끝의 dendrites에 돌기 쪽이를 해결하는 데 충분한 제공과 함께 사용 높은 수치 조리개 목적. 스케일 바 = 10 μm의.
그림 4 : microprism와 형광 염료의 꼬리 - 정맥 주사를 사용하여 얻은 이미지. 이미지가 대뇌 피질을 통해 볼륨에서 분기 깊은 두뇌 지역 및 작은 모세 혈관의 확장 수직, 구경이 큰 선박을 보여줍니다. 스케일 바 = 200 μm의.
그림 5 : 높은 수치 조리개 목표를 사용하여 네크로 텍스의 모세 혈관의 네트워크는보다 세부 군데하실 수 있습니다. 스케일 바 = 50 μm의.
그림 6 : 마이크로는 또한 혈관을 통해 흐르는 영상 붉은 혈액 세포 (RBCs)에 있습니다. RBCs은 형광 염료를 흡수하지 않으며 따라서 선박에 걸쳐 어두운 줄무늬로 볼 수 있습니다. 그릇에 걸쳐 라인 스캔하여, 하나는 RBC 유량 및 속도의 측정을 얻을 수 있습니다. 스케일 바 = 10 μm의 (상단 및 하단 이미지 가로 막대) 250 MS (아래 이미지에 수직 막대).
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Discussion
이미징 실험에서 microprism를 사용하면 비교적 간단하고 네크로 텍스의 생체내 연구에 많은 장점을 제공합니다. 이 기술을 사용하는 대표적인 예는 레이어 V 피질 뉴런에 노란색 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 생쥐에서 찍힌 사진을 포함합니다. 마이크로 사용하여 하나는 레이어 V 대형 피라미드 세포 기관의 집합, 대뇌 피질의 표면 아래 약 1mm를 볼 수 있습니다. 또한 플로팅 (그림 2)에 diverging하기 전에 모든 표면 레이어를 통해 연장 혀끝의 dendrites 있습니다 보았다. 이러한 실험에 사용되는 마우스는 계층 V 뉴런 (YFP - H 2) YFP을 표현하기위한 유전자 변형 동물입니다. 이러한 YFP - H의 마우스와 유리 보정 칼라와 높은 수치 조리개 목표를 사용하여 이미지보다 세부 dendrites을하는 것도 가능하고 돌기 쪽이 (그림 3)을 해결합니다.
하나는 또한 플루오레신 - dextran은 설립 꼬리 - 정맥 주사 기법을 사용하는 형광 염료와 대뇌 피질의 혈관에 레이블을 적용할 수 있습니다. 일반적으로 성인 쥐 20 생리 식염수에 MG / ML에서 플루오레신 - dextran의 100 UL의 볼러스 주입이 적합합니다. microprism가 (2.16 단계 이후) 네크로 텍스에 삽입 후 최상의 결과는 염료를 주입에서 왔어요. 이 기법을 사용 하나는 깊은 층에서 큰 구경의 혈관이 피아쪽으로 확장하고 microcapillaries의 네트워크 (그림 4)을 형성 해제 분기 볼 수 있습니다. 네크로 텍스의 microcapillaries 이러한 복잡한 네트워크는 가장 높은 수치 조리개 목표 (그림 5)를 사용하여 감사합니다.
또한, 이것은 선박 (그림 6, 상단 이미지에 빨간색 선)의 길이를 따라 라인 스캐닝에 의해 깊은 neocortical 모세 혈관에서 적혈구 세포 속도와 유량을 측정하는 것이 가능합니다. 적혈구는 형광 염료를하지 않기 때문에, 그들은 어두운 줄무늬로 나타납니다. 라인 스캔의 결과를 하나의 축의 공간적 차원과 다른 축에서 시간적 차원 (그림 6, 하단 이미지)를 가지고 이미지. 이러한 이미지에서 하나는 모세를 통해 적혈구의 자속과 속도를 계산할 수 있습니다. 그림 6의 경우, RBC 유량은 36 RBCs / 0.45 mm / 초의 속도와 두번째로 측정되었다. 이것은 문학 3 결과와 계약에 있습니다.
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Disclosures
동물 실험은 예일 대학의 IACUC에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
우리는 YFP 마우스를 제공 앤소니 J. Koleske, 박사 학위를 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| With enhanced silver reflective coating-(R77) | OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA) | 055-0010 | With enhanced silver reflective coating-(R77) |
| Fluorescein-dextran | Sigma-Aldrich | FD70 | 70 kDa |
| 0.28 NA, 4x air objective | Olympus Corporation | XLFLUOR 4x/340 | |
| 0.60 NA, 40x air objective | Olympus Corporation | LUCPLFLN | With 0-2 mm coverglass correction |
References
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).
