Summary
ימנית זווית microprisms מוכנס לתוך הניאוקורטקס העכבר מאפשר הדמיה עמוק של שכבות מרובות קליפת המוח עם מבט נמצא בדרך כלל פרוסה. אחת מילימטר microprisms מציעים בתחום של נוף רחב (~ 900 מיקרומטר) והחלטות מרחבי מספיק כדי לפתור את הקוצים הדנדריטים. אנו מדגימים שכבה V הדמיה עצבית הדמיה של כלי הדם neocortical באמצעות microprisms.
Abstract
אנו מציגים פרוטוקול בתחום ההדמיה vivo של רקמת קליפת המוח באמצעות בדיקה עמוק במוח הדמיה בצורת microprism. Microprisms הם 1 מ"מ בגודל יש ציפוי רפלקטיבי על היתר כדי לאפשר התבוננות פנימית של עירור אור פליטה. החללית microprism בו זמנית מספר רב של תמונות שכבות בקליפת המוח עם פרספקטיבה לראות בדרך כלל רק בהכנות פרוסה. תמונות נאספים עם גדול בתחום של נוף (~ 900 מיקרומטר). בנוסף, אנו מספקים פרטים על הליך בלתי הישרדות כירורגית ההתקנה מיקרוסקופ. תוצאות נציג לכלול תמונות של הנוירונים בשכבה V פירמידה מ Thy-1-H YFP בעכברים מראה דנדריטים apical שלהם הרחבת דרך שכבת קליפת המוח שטחית הרחבת לתוך הציציות. החלטה היה די כדי הדנדריטים התמונה קוצים ליד סומה של הנוירונים בשכבה V. הזרקה לווריד הזנב של צבע פלואורסצנטי חושף רשת סבוכה של כלי הדם בקליפת המוח. קו סריקה של כדוריות דם אדומות (RBCs) זורם דרך הנימים מגלה מהירות RBC ושיעורי השטף ניתן להשיג. זו בדיקה חדשנית microprism היא שיטה אלגנטית, חדשה וחזקה עדיין חזותי של מבנים הסלולר עמוק פונקציה קליפת המוח in vivo.
Protocol
חלק 1: אופטיקה Microprism ותוכנית ההתקנה מיקרוסקופ
- Microprisms אנו משתמשים הינם 1 מ"מ, בזווית ישרה מנסרות מזכוכית BK7 לרכוש חברת Optosigma (איור 1). Microprisms מטופלות באמצעות מלקחיים במידת האפשר.
- היתר של microprism מצופה כסף משופרת לספק רפלקטיביות של 97% יותר מאשר 400-2000 ננומטר. זה מספק התבוננות פנימית של שני אור לייזר עירור לבין הקרינה הנפלטת.
- Microprisms מטופלות תמיד באמצעות מלקחיים כאשר הדבר אפשרי. כפפות שחוקים בכל עת כדי לשמור על הפריזמה נקי.
- אנו משתמשים שהותקן שני פוטונים המיקרוסקופ מסוגל הדמיה של חיות קטנות. בעלי חיים, המחובר למכשיר stereotactic, ממוקם על הבמה 3-ציר ממונע.
- המיקרוסקופ מחובר למחשב Windows רץ תוכנה ScanImage. ScanImage היא רכישת תמונה תוכנה נכתב על ידי Matlab Pologruto ואח' 1.
- עבור הדמיה microprism, אנו אוספים תמונות ברזולוציה של 1024 x 1024 או 512 x 512 פיקסלים. בנוסף, אנו בדרך כלל סריקה בבית 2 ms / או קו 4 ms / קו.
- שני סוגים של מטרות משמשים בניסויים:
- צמצם נמוך מספרית (NA) אוויר אובייקטיבי הדמיה בתחום רחב של נוף (ראו טבלה של חומרים כימיים וציוד).
- NA גבוה אובייקטיבי אוויר עם צווארון זכוכית תיקון מסוגל מזעור סטיות המושרה על ידי כדורי 0-2 מ"מ זכוכית (ר 'טבלה של חומרים כימיים וציוד).
- כאשר החיה מוכן הדמיה תחת מטרה בהגדלה נמוכה, ליישר את דפוס raster מרובע סריקה של הלייזר עם החלק העליון של microprism. זה יעזור לכוון את התמונה ולעשות שימוש יעיל של כוח לייזר.
- שימוש גבוה יותר אובייקטיבי NA עם צווארון תיקון זכוכית, להגדיר את צווארון תיקון לתקן כ 1 מ"מ זכוכית. לאחר תמונה פלורסנט מופיע במהלך הניסוי, אפשר להגיע בזהירות בתוך מיקרוסקופ כדי לייעל את צווארון תיקון על מנת למקסם את רזולוציית הדמיה.
חלק 2: Non-הישרדות כירורגיה בעלי חיים הכנסת Microprism
- משך ההליך כולו, מן החתך הראשוני עד לסיום הדמיה, תלוי את מטרות הניסוי. עם זאת, המיקום הלא הישרדות microprism הליך כירורגי וניתן לצפות לקחת כ 30-40 דקות.
- עכברים (P30-P60) הם שקלו כראוי בהרדמה באמצעות זריקה IP של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) למישור מתאים ניתוחים.
- במהלך הניסוי כולו, החיה יש לבדוק כל 15-20 דקות כדי להעריך את רמתו של הרדמה. אם החיה מגיבה חברת הבוהן קמצוץ, מנה של קטמין משלים / xylazine נדרשת. בדרך כלל מנה משלים הוא שליש המינון הראשוני יכול להיות מוכן מראש של מזרק להזרקה IP מיידי במקרה הצורך.
- לאחר העכבר הוא הרדים כראוי, הרוב של השיער על הראש של החיה הוא גילח באמצעות גוזם עם להב # 40.
- נאיר ® מוחל על השערות שנותרו על ראשו כדי לסייע ליצור משטח ללא שערות שעלולות להפריע של microprism במהלך ההדמיה. אחרי 5 דקות, ® נאיר הוא ניקה באמצעות מטלית כותנה שקצהו.
- החיה הרדים ממוקם כראוי לתוך מכשיר stereotactic העכבר. במהלך ניתוחים הפעלות הדמיה חיה נשמר על כרית חימום מים מלאים נקבע על 36 מעלות צלזיוס.
- עם ראש של חיה קבוע כראוי במקום אחד חתך נקי נעשית באמצעות אזמל לאורך הקו המדיאלי של הגולגולת כדי להפריד את העור.
- כמות קטנה של מי חמצן 3% מושם על כותנה שקצהו ספוגית ותוחל הגולגולת כדי לנקות את הקרומים שבין הגולגולת לבין העור.
- מי חמצן גם עוזר לחשוף גבחת, ציון דרך חשוב לדעת היכן לבצע את craniotomy והכנס את microprism.
- לפני craniotomy הוא התחיל, ברים האוזן בר לנשוך מותאמים כהלכה כדי להטות את הגולגולת חשוף כזה שזה בעצם רמה עם השולחן. זה מספק פלטפורמה טובה יותר עבור craniotomy. בנוסף, זה הופך את המשטח העליון של הניצב פריזמה עם האור עירור נכנסות. זה יעזור למזער סטיות אופטיות תוך הדמיה.
- בר שיניים קטן (~ 0.8 ראש בגודל מ"מ) מחוברת לכלי Dremel ® באמצעות זרוע הארכה גמיש. עבור craniotomies, אנו קובעים את המהירות לכ 7,000 ל -10,000 rpms.
- בר שיניים הוא רזה לאורך הגולגולת עד חריץ הכיכר הוקמה בשנת העצם. הצדדים של הכיכר כ 2-3 מ"מ אורך ו 1.5 במרכז הזנב מ"מ 1 מ"מ לרוחב גבחת.
- המשך דילול העצם עד פתח קטן הוא עשה דרך הגולגולת. זוג מלקחיים can להרים את דש עצם מן הגולגולת.
- דורה יש להסיר לפני microprism יכול להיות מוכנס לתוך קליפת המוח. דימום נשלטת על ידי מיטב לתת לדם להקריש על פני השטח במשך מספר דקות. לאחר מכן, בדם קרוש מוסר באמצעות ספוג כירורגית לפני הכנסת microprism.
- כדי לעזור לסייע ביישור של פריזמה עם קליפה, פנים האנכי של microprism היא בשורה במקביל מטפל על מלקחיים.
- עם פריזמה החזיקו כראוי, microprism כולו מוכנס עד החלק העליון של פריזמה הוא מיושר עם משטח neocortical.
- כאשר מוכנס בצורה נכונה, microprism צריך להישאר במצב הנכון. כל דימום כי התוצאות הוא מינימלי יכול להיספג עם ספוג כירורגי קטן. לאחר פריזמה נמצאת במקום החיה מוכן הדמיה.
- לאחר microprism נעשה שימוש בבעלי חיים, זה יכול להיות שימוש חוזר מספר פעמים. לעומת זאת, יש לנקות היטב כדי להסיר כל חומר ביולוגי הנותרים. ניתן להשיג זאת על ידי טבילה פריזמה לתוך נפח קטן של חומצה HCl, ואחריו טבילה לתוך מתנול. Microprism לנקות אז יכול להיות עטוף בנייר העדשה עד לשימוש עתידי.
חלק 3: תוצאות נציג
איור 1: תמונות של microprism ימנית זווית. פריזמות השתמשו בניסוי הזה הם אחד מילימטר, מנסרות BK7 זכוכית עם ציפוי כסף משופרת על היתר כדי לאפשר התבוננות פנימית של עירור אור פליטה.
איור 2: תמונה של שכבה V נוירונים YFP פירמידה. הדמיה בתחום רחב של נוף עם microprism מגלה אוכלוסיה גדולה של גופי התא פירמידה ~ 800-900 מיקרומטר עמוק מפני השטח של קליפת המוח. בנוסף, דנדריטים apical הארכת לכיוון שכבת אני גם יכול להיפתר. בר סולם = 200 מיקרומטר.
איור 3: המטרה הצמצם המספרי גבוה בשילוב עם microprism מספק רזולוציה מרחבית מספיק כדי לפתור הקוצים הדנדריטים על דנדריטים apical הנוירונים בשכבה V פירמידה. בר סולם = 10 מיקרומטר.
איור 4: תמונה שהושגו באמצעות microprism וגם זנב זריקה לווריד של צבע פלואורסצנטי. התמונה מראה אנכית, כלי קליבר גדול המשתרעת באזורי מוח עמוקים נימים קטנים הסתעפות דרך בנפח קליפת המוח. בר סולם = 200 מיקרומטר.
איור 5: שימוש מטרה גבוהה יותר הצמצם מספרית, רשת של נימים בתוך הניאוקורטקס ניתן הדמיה עם בפירוט רב יותר. בר סולם = 50 מיקרומטר.
איור 6: Microprisms גם מאפשר הדמיה תאים דם אדומים (RBCs) זורם דרך כלי. RBCs לא לספוג את צבע פלואורסצנטי ולכן נתפסים פסים כהים על פני כלי השיט. על ידי סריקה קו לרוחב הכלי, ניתן להשיג מדידות של שטף RBC ומהירות. בר סולם = 10 מיקרומטר (הפס האופקי בתמונה למעלה ולמטה) ו 250 ms (סרגל אנכי בתמונה למטה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שימוש microprism בניסוי הדמיה היא פשוטה יחסית, מציע יתרונות רבים עבור במחקרים vivo על הניאוקורטקס. דוגמאות מייצגות באמצעות טכניקה זו כוללת תמונות שצולמו מן העכברים הטרנסגניים לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב נוירונים בקליפת המוח שכבה V. שימוש microprisms ניתן לראות אוסף גדול של גופי התא פירמידה בשכבה V, כמעט 1 מ"מ מתחת לפני השטח של קליפת המוח. ראו גם הם דנדריטים apical שמרחיבים דרך כל השכבות השטחיות לפני לסטות לתוך עטרות (איור 2). העכברים המשמשים בניסויים אלה הם בעלי חיים מהונדס נועד להביע YFP רק בשכבה V נוירונים (YFP-H 2). שימוש אלה YFP-H עכברים מטרה גבוהה יותר הצמצם המספרי עם צווארון תיקון זכוכית אפשר גם את התמונה עם דנדריטים בפירוט רב יותר ולפתור הקוצים הדנדריטים (איור 3).
אפשר גם תווית כלי הדם בקליפת המוח עם פלורסנט לצבוע כמו והעמסת-dextran באמצעות הוקמה זנב וריד טכניקות ההזרקה. בדרך כלל, על עכברים בוגרים זריקה 100 ul בולוס של והעמסת-dextran ב 20 מ"ג / מ"ל תמיסת מלח פיזיולוגית מתאימה. את התוצאות הטובות ביותר מגיעות הזרקת צבע לאחר microprism שובצה הניאוקורטקס (לאחר שלב 2.16). באמצעות טכניקה זו ניתן לראות את כלי קליבר גדול משכבות עמוקות הארכת כלפי פיא הסתעפות כדי ליצור את הרשת של microcapillaries (איור 4). רשת זו מורכבת של microcapillaries ב הניאוקורטקס מוערכת הטובה ביותר באמצעות מטרה גבוהה הצמצם המספרי (איור 5).
בנוסף, ניתן למדוד תא דם אדום, מהירות השטף של נימים neocortical עמוק על ידי סריקת קו אורך של כלי (איור 6, קו אדום בתמונה למעלה). מאז כדוריות הדם האדומות לא לוקחים את צבע פלואורסצנטי, הם יופיעו פסים כהים. תמונות הנובעות לסרוק קו יש מימד מרחבי אחד הצירים ואת הממד הטמפורלי של צירים אחרים (איור 6, תמונה למטה). מתוך תמונות אלו, ניתן לחשב את השטף ומהירות של כדוריות דם אדומות דרך נימי. במקרה של דמות 6, השטף RBC נמדדה להיות 36 RBCs / שנייה עם מהירות של 0.45 מ"מ / שנייה. מדובר בהסכם עם תוצאות מהספרות 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי IACUC באוניברסיטת ייל.
Acknowledgments
אנו מודים אנתוני ג'יי Koleske, PhD למתן העכברים YFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| With enhanced silver reflective coating-(R77) | OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA) | 055-0010 | With enhanced silver reflective coating-(R77) |
| Fluorescein-dextran | Sigma-Aldrich | FD70 | 70 kDa |
| 0.28 NA, 4x air objective | Olympus Corporation | XLFLUOR 4x/340 | |
| 0.60 NA, 40x air objective | Olympus Corporation | LUCPLFLN | With 0-2 mm coverglass correction |
References
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).
