Summary
Fare neokorteks takılı sağ açılı microprisms genellikle dilim içinde bulunan bir bakış açısı ile birden fazla kortikal katmanları derin görüntüleme için izin verir. Bir milimetrelik microprisms geniş bir alan-view (~ 900 mm) ve dendritik dikenler çözmek için yeterli uzaysal çözünürlük sunuyor. Biz katmanı V nöronal görüntüleme ve microprisms kullanarak neokortikal vasküler görüntüleme göstermektedir.
Abstract
Biz bir micropism şeklinde derin bir beyin görüntüleme probu kullanarak kortikal doku in vivo görüntüleme için bir protokol mevcut. Microprisms boyutu 1 mm ve hipotenüs, eksitasyon ve emisyon ışık iç yansıma izin vermek için bir yansıtıcı kaplama var. Micropism prob aynı anda bir bakış açısı ile görüntüleri birden fazla kortikal tabakalar genellikle sadece dilim hazırlıkları görülmektedir. Görüntüler ile büyük bir alan görünümü (~ 900 mm). Buna ek olarak, hayatta olmayan bir cerrahi işlem ve mikroskop kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Temsilcisi sonuçları, yüzeysel kortikal tabaka boyunca uzanan ve Tufts uzanan apikal dendritler gösteren Thy-1 YFP-H fareler katmanı V piramidal nöronlar görüntüleri içerir. Çözünürlük katmanı V nöronların soma yakın görüntü dendritik dikenler için yeterli oldu. Floresan boya kuyruk ven enjeksiyon kortekste kan damarlarının karmaşık ağ ortaya koymaktadır. Kılcal damarlar yoluyla akan kırmızı kan hücreleri (eritrositler) Line-tarama RBC hız ve akı oranları elde edilebilir ortaya koymaktadır. Bu roman micropism prob derin hücresel yapılar ve in vivo olarak kortikal fonksiyon görselleştirmek zarif ama güçlü bir yeni bir yöntem.
Protocol
Bölüm 1: micropism Optik ve Mikroskop Kurulum
- Kullandığımız microprisms Optosigma Corporation (Şekil 1) alınan BK7 camdan yapılan 1 mm, dik açılı prizmalar. Microprisms mümkün forseps kullanarak işlenir.
- 2000 nm - micropism hipotenüs 400% 97 daha fazla yansıtma sağlamak için geliştirilmiş gümüş ile kaplanır. Bu lazer uyarma ışık ve yayılan floresan hem de iç yansıma sağlar.
- Microprisms her zaman mümkün olduğunda forseps kullanarak işlenir. Eldiven prizma temiz tutmak için her zaman giyilir.
- Biz küçük hayvan görüntüleme kapasitesine sahip bir özel inşa edilmiş iki foton mikroskop kullanıyoruz. Stereotaktik cihaza bağlı hayvan, 3-eksenli bir motorlu sahnede yer almaktadır.
- Mikroskop ScanImage yazılımı çalıştıran bir Windows PC'ye bağlı. ScanImage Pologruto ve ark 1 Matlab yazılı bir görüntü elde etme yazılımı .
- Micropism görüntüleme için 1024 x 1024 veya 512 x 512 piksel çözünürlükte görüntüler topluyoruz. Buna ek olarak, biz genellikle 2 ms / satır veya 4 ms / satır tarayın.
- İki tür hedeflerin deneylerde kullanılır:
- Geniş alan görüş görüntüleme için daha düşük bir sayısal açıklık (NA) hava hedefi (Tablo Reaktifler ve Ekipmanları).
- 0 tarafından uyarılan küresel sapmaları en aza indirmek yeteneğine sahip bir cam düzeltme yakalı bir yüksek NA hava hedefi - 2 mm cam (bkz. Reaktifler ve Ekipmanları Tablo) .
- Hayvan, düşük bir büyütme amacı altında görüntüleme için hazır olduğunda, micropism üst lazer kare raster tarama desen aynı hizaya getirin. Bu yönlendirmek görüntü ve lazer güç verimli kullanımını sağlamaya yardımcı olacak.
- Cam bir düzeltme yaka ile daha yüksek bir NA amacı kullanarak, yaklaşık 1 mm cam için doğru düzeltme yaka ayarlayın. Floresan görüntü deney sırasında göründüğünde, bir dikkatle, görüntü çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için düzeltme yaka optimize etmek için mikroskop içinde ulaşabilirsiniz.
Bölüm 2: Sigara hayatta Hayvan Cerrahisi ve micropism Ekleme
- Tüm prosedürü uzunluğu, ilk kesi görüntüleme tamamlanıncaya kadar, deney hedeflerine bağlıdır. Tamamlamak için 40 dakika hayatta olmayan cerrahi prosedür ve micropism yerleştirme Ancak, yaklaşık 30 almak için bekleniyor olabilir.
- Fare (P30-P60) tartılır ve uygun cerrahi işlemler için uygun bir uçak anestezi ketamin (100 mg / kg) ve xylazine (10 mg / kg) bir IP enjeksiyon kullanarak.
- Tüm deney boyunca, hayvan anestezi seviyesini değerlendirmek için her 15-20 dakikada bir kontrol edilmelidir. Hayvan tepki sağlam bir ayak tutam ilave bir doz ketamin / xylazine gereklidir. Tipik bir ek doz ilk dozun üçte biri ve gerekirse acil IP enjeksiyon için bir şırınga içinde önceden hazırlanmış olabilir.
- Fareyi doğru uyuşturulduktan sonra, hayvanın kafasına saç çoğunluğu # 40 bıçak ile bir düzenleyici kullanarak kazınıyor.
- Nair ® görüntüleme sırasında micropism şekilde alabilirsiniz kılların ücretsiz bir yüzey oluşturmak yardımcı olmak için baş kalan kıllar için uygulanır. Nair ® 5 dakika sonra, bir pamuk uçlu çubuk yardımıyla temizlenir.
- Anestezi hayvan düzgün bir fare stereotaktik cihazın içine yerleştirilir. Cerrahi işlemler ve görüntüleme oturumları sırasında hayvan 36 santigrat derece sıcaklıkta su dolu ısıtma yastığı tutulur.
- Hayvanın kafa ile düzgün bir yerde sabit, temiz bir kesi kafatası medial satır aşağı cilt ayırmak için bir neşter kullanılarak yapılır.
- % 3 hidrojen peroksit küçük bir miktar pamuk uçlu bir bez üzerinde yerleştirilir ve kafatası, kafatası ve cilt arasındaki membranlar temizlemek için uygulanır.
- Hidrojen peroksit de bregma kraniotomi gerçekleştirmek ve micropism eklemek için bilerek, önemli bir dönüm noktası ortaya çıkarmak için yardımcı olur.
- Kraniotomi başlamadan önce, kulak bar ve snack bar, düzgün bir tablo ile temel düzeyde olduğu gibi açıkta kalan kafatası yatırmak için ayarlanır. Bu kraniotomi için daha iyi bir platform sağlar. Buna ek olarak, bu gelen uyarma ışığı ile üst yüzeyine dik prizma yapar. Bu görüntüleme sırasında optik sapmaları en aza indirmeye yardımcı olacaktır.
- Küçük bir diş çapak (~ 0.8 mm kafa boyutu), esnek bir uzatma kolu kullanarak bir Dremel ® araç bağlıdır. Cerrahinin için, yaklaşık olarak 7.000 ila 10.000 rpms hızını ayarlayabilirsiniz.
- Kadar bir kare oluk kemik yılında kurulan diş çapak kafatası boyunca yağsız. Meydanın iki tarafında yaklaşık 2-3 mm uzunluğunda ve 1,5 mm kaudal ve bregma lateral 1 mm merkezli.
- Kemik incelmesi kafatasına küçük bir delik aracılığıyla yapılıncaya kadar devam etmektedir. Forseps ca bir çiftn uzak kafatası kemik flep kaldırın.
- Dura micropism korteks eklenebilir önce kaldırılması gerekiyor. Kanama, kan birkaç dakika için yüzey koagüle sağlayarak en iyi kontrol edilir. Daha sonra, pıhtılaşmış kan micropism takmadan önce cerrahi sünger kullanarak kaldırılır.
- Korteks ile prizma uyum yardımcı yardımcı olmak için, dikey yüz micropism forseps kolları paralel dizilmiş olan.
- Prizma üst neokortikal yüzeyi ile aynı hizada olacak kadar düzgün düzenlenen prizma ile, tüm micropism eklenir.
- Doğru takıldığında micropism, düzgün bir pozisyonda kalmalıdır. Sonucu herhangi bir kanama az ve küçük bir cerrahi sünger ile absorbe edilebilir. Prizma yerleştirildikten sonra hayvan görüntüleme için hazırdır.
- Micropism bir hayvan olarak kullanıldıktan sonra, birkaç kez yeniden kullanılmış olabilir. Ancak, düzgün kalan herhangi bir biyolojik materyal kaldırmak için temizlenmesi gerekir. Bu, küçük bir hacim HCl asit, metanol içine dalış takip içine prizma daldırma ile yapılabilir. Temizlenen micropism sonra ileride kullanmak kadar objektif kağıdı ile sarılmış olabilir.
Bölüm 3: Temsilci Sonuçlar
Şekil 1: dik açılı micropism görüntüler. Bu deneyde kullanılan Prizmalar, hipotenüs üzerine, eksitasyon ve emisyon ışık iç yansıma izin vermek için geliştirilmiş bir gümüş kaplama ile bir milimetre, BK7 cam prizmalar.
Şekil 2: Image katmanı V YFP piramidal nöronların. Derin kortikal yüzeyinden 900 mikron - micropism Geniş alan görünümü görüntüleme ~ 800 piramidal hücre gövdeleri büyük bir nüfus ortaya koymaktadır. Buna ek olarak, katman doğru uzanan apikal dendritler Ben de çözülecektir. Ölçeği bar = 200 mm.
Şekil 3: micropism uzaysal çözünürlük katman V piramidal nöronlar apikal dendritler dendritik dikenler çözmek için yeterli sağlar birlikte kullanılan yüksek sayısal diyafram objektif. Ölçek çubuğu = 10 mm.
Şekil 4: micropism ve floresan boya kuyruk ven enjeksiyon kullanılarak elde edilen bir görüntü. Görüntü kortikal hacmi ile dallara derin beyin bölgeleri ve küçük kılcal damarları uzanan dikey, büyük kalibreli damarları gösterir. Ölçeği bar = 200 mm.
Şekil 5: neokorteks, daha yüksek bir sayısal diyafram objektif kullanımı, kılcal damar ağı daha ayrıntılı görüntülenebilir . Ölçek çubuğu = 50 mm.
Şekil 6: Microprisms damarları aracılığıyla akan görüntüleme kırmızı kan hücreleri (eritrositler) sağlar. Eritrositlerde floresan boya emer ve bu nedenle geminin üzerinde koyu çizgiler olarak görülür. Gemi karşısında hat-tarama, bir RBC akı ve hız ölçümleri elde edebilirsiniz. Ölçek çubuğu = 10 mm (üst ve alt görüntü yatay çubuk) ve 250 ms (alttaki resim dikey çubuk).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir görüntüleme deneyde micropism kullanmak oldukça basit ve neokorteks in vivo çalışmalar için birçok avantaj sunuyor. Bu tekniği kullanarak Temsilcisi örnekler katman V kortikal nöronların sarı floresan protein eksprese eden transgenik farelerin alınan görüntüleri içerir. Microprisms kullanarak bir katman V büyük piramidal hücre gövdeleri bir koleksiyon, yaklaşık 1 mm kortikal yüzey altında görebilirsiniz. Ayrıca, Tufts (Şekil 2) içine uzaklaşan önce tüm yüzeysel katmanları üzerinden yayılan apikal dendritler görülmektedir. Bu deneyler için kullanılan fareler, transgenik hayvanlar, sadece katmanı V nöron (YFP-H 2) YFP ifade etmek için tasarlanmıştır. Bu YFP-H fareler ve cam bir düzeltme yaka ile daha yüksek bir sayısal diyafram objektif kullanarak görüntü daha ayrıntılı ve dendritler de mümkündür ve dendritik dikenler çözmek (Şekil 3).
Bir de böyle kurulmuş kuyruk ven enjeksiyon teknikleri kullanarak fluorescein-dekstran gibi bir floresan boya ile kortikal kan damarlarının etiket. Normalde, yetişkin farelerin için 20 mg / ml serum fizyolojik fluorescein-dekstran 100 ul bolus enjeksiyon uygundur. En iyi sonuçlar boya enjekte micropism (2.16 adım sonra) neokorteks takıldıktan sonra gelir. Bu tekniği kullanarak bir derin katmanlarından büyük kalibreli damarları pia doğru uzanan ve mikrokapilerler ağ (Şekil 4) forma kapalı dallanma görebilirsiniz. Neokorteks mikrokapilerler bu karmaşık ağı en yüksek sayısal açıklık objektif (Şekil 5) ile takdir edilmektedir.
Buna ek olarak, bir geminin uzunluğu boyunca (Şekil 6, üst resimde kırmızı çizgi) line-tarama ile derin neokortikal kılcal damarları kırmızı kan hücre hız ve akı ölçmek mümkündür. Kırmızı kan hücrelerine floresan boya alma olmadığından, onlar koyu çizgiler olarak görünecektir. Görüntüler bir hat-tarama sonucu bir eksende bir mekansal boyutu ve diğer eksende zamansal bir boyut vardır (Şekil 6, alt resim). Bu görüntüleri, bir kılcal damar yoluyla, kırmızı kan hücrelerinin akı ve hız hesaplayabilirsiniz. Şekil 6, RBC akı 36 eritrosit / 0,45 mm / sn hız ile ikinci olarak ölçüldü. Bu literatür sonuçları 3 ile anlaşma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yale Üniversitesi IACUC tarafından belirtilen kurallar ve düzenlemelere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Anthony J. Koleske, Doktora YFP fareler sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| With enhanced silver reflective coating-(R77) | OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA) | 055-0010 | With enhanced silver reflective coating-(R77) |
| Fluorescein-dextran | Sigma-Aldrich | FD70 | 70 kDa |
| 0.28 NA, 4x air objective | Olympus Corporation | XLFLUOR 4x/340 | |
| 0.60 NA, 40x air objective | Olympus Corporation | LUCPLFLN | With 0-2 mm coverglass correction |
References
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).
