Summary
Angolo retto microprismi inserita nella neocorteccia del mouse permette l'imaging con profonda di più strati corticali con un punto di vista tipicamente si trovano in fetta. Un millimetro microprismi offrono un ampio campo di vista (~ 900 micron) e risoluzione spaziale sufficiente per risolvere spine dendritiche. Dimostriamo strato di imaging neuronale V e neocorticale imaging vascolare con microprismi.
Abstract
Vi presentiamo un protocollo per l'imaging in vivo di tessuto corticale utilizzando una profonda sonda di imaging del cervello in forma di microprismi. Microprismi sono 1-mm e hanno un rivestimento riflettente l'ipotenusa per consentire riflessione interna di eccitazione e di emissione di luce. La sonda microprismi contemporaneamente più immagini strati corticali con una prospettiva tipicamente visto solo in preparati fetta. Le immagini sono raccolte in un grande campo di vista (~ 900 micron). Inoltre, forniamo i dettagli sulla non-sopravvivenza procedura chirurgica e la configurazione microscopio. Risultati rappresentativi includono immagini dello strato V neuroni piramidali da Thy-1-H YFP topi mostrano il loro dendriti apicali si estende attraverso lo strato superficiale della corteccia e si estende in ciuffi. Risoluzione è stata sufficiente a immagine spine dendritiche nei pressi del soma di strato di neuroni V. Una coda vena iniezione di colorante fluorescente svela l'intricata rete di vasi sanguigni nella corteccia. Scansione lineare di globuli rossi (RBC) che fluisce attraverso i capillari rivela la velocità dei globuli rossi e tassi di flusso possono essere ottenuti. Questa sonda microprismi romanzo è un elegante metodo nuovo e potente di visualizzare profonde strutture cellulari e la funzione corticale in vivo.
Protocol
Parte 1: Ottica microprismi e l'installazione Microscopio
- Il microprismi da noi utilizzati sono di 1 mm, ad angolo retto prismi a base di vetro BK7 acquistati dal Optosigma Corporation (Figura 1). Microprismi sono trattati con pinze quando possibile.
- L'ipotenusa del microprismi è rivestita con argento migliorato per fornire una riflettività superiore al 97% 400-2000 nm. Ciò fornisce riflessione interna sia la luce laser di eccitazione e la fluorescenza emessa.
- Microprismi sono sempre trattati con pinze quando possibile. I guanti sono indossati in ogni momento a tenere pulito il prisma.
- Usiamo un custom-built microscopio a due fotoni in grado di piccoli animali di imaging. L'animale, collegare al dispositivo stereotassica, è posto su un palco a 3 assi motorizzati.
- Il microscopio è collegato ad un PC Windows in esecuzione il software scanimage. Scanimage è software di acquisizione immagini scritto in Matlab da Pologruto et al 1.
- Per l'imaging microprismi, raccogliamo le immagini con una risoluzione di 1024 x 1024 o 512 x 512 pixel. Inoltre, di solito la scansione a 2 ms / riga o 4 ms / linea.
- Due tipi di obiettivi sono utilizzati negli esperimenti:
- Una minore apertura numerica (NA) obiettivo aria per ampio campo di vista per immagini (vedi Tabella di reagenti e macchinari).
- Un obiettivo più alto d'aria NA con un collare di correzione di vetro in grado di minimizzare le aberrazioni sferiche indotta da 0 - 2 mm di vetro (vedi Tabella di reagenti e macchinari).
- Quando l'animale è pronto per l'imaging con un obiettivo a basso ingrandimento, allineare il modello quadrato raster di scansione del laser con la parte superiore del microprismi. Questo aiuterà l'immagine orientarsi e fare un uso efficiente della potenza del laser.
- Utilizzando un obiettivo più alto NA con un collare di correzione di vetro, impostare il collare di correzione per correggere circa 1 mm di vetro. Una volta che l'immagine fluorescente viene visualizzata durante l'esperimento, si può raggiungere con cura all'interno del microscopio per ottimizzare il collare di correzione per ottimizzare la risoluzione delle immagini.
Parte 2: non la sopravvivenza degli animali e Chirurgia inserzione microprismi
- La lunghezza intera procedura, dalla incisione iniziale fino al completamento di imaging, dipende dagli obiettivi dell'esperimento. Tuttavia, la disposizione non sopravvivenza procedura chirurgica e microprismi si può aspettare che richiede circa 30 - 40 minuti per essere completato.
- Topi (P30-P60) vengono pesati e anestetizzati con una iniezione opportunamente IP di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) a un piano adatto per interventi chirurgici.
- Per tutto l'intero esperimento, l'animale deve essere controllato ogni 15-20 minuti per valutare il livello di anestesia. Se l'animale reagisce a una ditta di convergenza pizzico, una dose supplementare di ketamina / xylazina è richiesto. In genere una dose supplementare è un terzo della dose iniziale e può essere preparata in anticipo in una siringa per l'immediata iniezione IP, se necessario.
- Una volta che il mouse viene adeguatamente anestetizzato, la maggior parte dei capelli sulla testa dell'animale è radere utilizzando un decespugliatore con lama # 40.
- Nair ® è applicato al peli rimasti sulla testa per creare una superficie libera di peli che possono ottenere nel senso della microprismi durante imaging. Dopo 5 minuti, la Nair ® è rimosso con un tampone di cotone con punta.
- L'animale anestetizzato è correttamente inserito in un dispositivo stereotassico mouse. Durante le procedure chirurgiche e le sessioni di imaging l'animale è mantenuto su un pieno d'acqua, piastra elettrica fissato a 36 gradi Celsius.
- Con la testa dell'animale correttamente fissata al suo posto, una incisione pulito è effettuata utilizzando un bisturi lungo la linea mediana del cranio per separare la pelle.
- Una piccola quantità di perossido di idrogeno al 3% è collocato su un batuffolo di cotone con punta e applicata al cranio per eliminare le membrane tra il cranio e la pelle.
- Il perossido di idrogeno aiuta anche a svelare bregma, un punto di riferimento importante nel sapere dove eseguire la craniotomia e inserire il microprismi.
- Prima che la craniotomia è avviato, il bar e il bar morso all'orecchio siano regolate correttamente per inclinare il cranio esposti in modo tale che è fondamentalmente il livello con la tabella. Ciò fornisce una piattaforma migliore per la craniotomia. Inoltre, questo rende la superficie superiore della perpendicolare prisma con la luce di eccitazione in arrivo. Questo contribuirà a minimizzare le aberrazioni ottiche, mentre imaging.
- Una piccola bava dentale (~ 0.8 dimensioni della testa mm) è collegato ad uno strumento di Dremel ® utilizzando un braccio flessibile estensione. Per craniotomie, abbiamo impostato la velocità a circa 7.000 a 10.000 giri.
- La bava dentale è scremato lungo il cranio fino a quando un solco quadrato è stabilita nelle ossa. I lati della piazza sono circa 2-3 mm di lunghezza e 1,5 centrato caudale mm e 1 mm lateralmente al bregma.
- Proseguendo assottigliamento dell'osso fino a una piccola apertura è fatta attraverso il cranio. Un paio di pinze can sollevare il lembo osseo lontano dal cranio.
- La durata deve essere rimosso prima che il microprismi può essere inserito nella corteccia. Il sanguinamento è controllato meglio lasciando coagulare il sangue in superficie per alcuni minuti. Successivamente, il sangue coagulato viene rimosso con una spugna chirurgica prima di inserire la microprismi.
- Per aiutare aiutare l'allineamento del prisma con la corteccia, la faccia verticale del microprismi è allineata parallelamente alle maniglie del forcipe.
- Con il prisma correttamente affermato, la microprismi tutto viene inserito fino a quando la parte superiore del prisma è a filo con la superficie neocorticale.
- Una volta inserito correttamente, il microprismi dovrebbe rimanere nella posizione corretta. Qualsiasi sanguinamento che ne deriva è minimo e può essere assorbito con una piccola spugna chirurgica. Una volta che il prisma è al suo posto l'animale è pronto per l'imaging.
- Dopo un microprismi è stato utilizzato in un animale, può essere riutilizzato più volte. Tuttavia, ha bisogno di essere puliti per rimuovere tutto il materiale residuo biologico. Questo può essere ottenuto immergendo il prisma in un piccolo volume di HCl acido, seguita da un tuffo in metanolo. Il microprismi pulite possono poi essere avvolti in carta per lenti fino al momento dell'uso futuro.
Parte 3: Risultati Rappresentante
Figura 1: Immagini del angolo retto microprismi. Prismi utilizzati in questo esperimento sono un millimetro, prismi di vetro BK7 con un rivestimento in argento rafforzata sulla ipotenusa per consentire riflessione interna di eccitazione e di emissione di luce.
Figura 2: Immagine dello strato V YFP neuroni piramidali. Ampio campo di vista di imaging con i microprismi rivela una vasta popolazione di corpi cellulari piramidali ~ 800-900 micron in profondità dalla superficie corticale. Inoltre, dendriti apicali che si estende fino alla strato posso anche essere risolto. Barra di scala = 200 micron.
Figura 3: Un obiettivo apertura superiore numerico utilizzato in combinazione con il microprismi offre risoluzione spaziale sufficiente a risolvere spine dendritiche sui dendriti apicali sul livello V neuroni piramidali. Barra di scala = 10 micron.
Figura 4: L'immagine ottenuta utilizzando il microprismi e una coda-vena iniezione di colorante fluorescente. L'immagine mostra verticale, vasi di grosso calibro che si estende da regioni cerebrali profonde e più piccoli capillari che si diramano attraverso il volume corticale. Barra di scala = 200 micron.
Figura 5: Utilizzo di un obiettivo più alto apertura numerica, la rete di capillari nella neocorteccia può essere ripreso con maggiore dettaglio. Barra di scala = 50 micron.
Figura 6: microprismi consente anche per l'imaging globuli rossi (RBC) che scorre attraverso i vasi. Globuli rossi non assorbono il colorante fluorescente e quindi sono viste come strisce scure che attraversano la nave. Con la scansione lineare attraverso il vaso, si può ottenere misurazioni del flusso dei globuli rossi e velocità. Barra di scala = 10 micron (barra orizzontale di immagine superiore e inferiore) e 250 ms (barra verticale in immagine in basso).
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Discussion
Utilizzando un microprismi in un esperimento di imaging è relativamente semplice e offre molti vantaggi per studi in vivo sul neocorteccia. Esempi rappresentativi di questa tecnica includono immagini tratte da topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente gialla nello strato V neuroni corticali. Utilizzando microprismi si può vedere una collezione di grandi corpi cellulari piramidali dello strato V, quasi 1 mm sotto la superficie corticale. Visto anche i dendriti apicali che si estendono attraverso tutti gli strati superficiali prima divergenti in ciuffi (Figura 2). I topi utilizzati per questi esperimenti sono animali transgenici progettato per esprimere YFP solo nello strato V neuroni (YFP-H 2). L'utilizzo di questi YFP-H topi e un obiettivo più alto apertura numerica con un collare di correzione di vetro è possibile anche per l'immagine del dendriti con maggiore dettaglio e risolvere spine dendritiche (Figura 3).
Si può anche etichettare i vasi sanguigni corticale con un colorante fluorescente come la fluoresceina destrano utilizzando stabilito coda vena tecniche di iniezione. In genere, per topi adulti un 100 ad iniezione in bolo di fluoresceina ul-destrano a 20 mg / ml in soluzione fisiologica è appropriato. I migliori risultati provengono da iniettare il colorante dopo la microprismi è stata inserita nella neocorteccia (dopo il punto 2.16). Utilizzando questa tecnica si possono vedere i vasi di calibro maggiore da strati profondi si estende verso la pia e si dirama a formare la rete di microcapillari (Figura 4). Questa rete intricata di microcapillari nella neocorteccia si apprezza meglio con un obiettivo ad alta apertura numerica (Figura 5).
Inoltre, è possibile misurare la velocità dei globuli rossi e del flusso dal profondo neocorticale capillari da scansione lineare su tutta la lunghezza di una nave (figura 6, linea rossa nell'immagine in alto). Dal momento che i globuli rossi non tengono il colorante fluorescente, appariranno come striature scure. Le immagini che risultano da una linea di scansione hanno una dimensione spaziale in una assi e una dimensione temporale in altri assi (figura 6, immagine in basso). Da queste immagini, si può calcolare il flusso e la velocità dei globuli rossi attraverso il capillare. Nel caso di figura 6, il flusso RBC è stato misurato da 36 GR / secondo con una velocità di 0,45 mm / secondo. Questo è in accordo con i risultati della letteratura 3.
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Disclosures
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal IACUC della Yale University.
Acknowledgments
Ringraziamo Anthony J. Koleske, PhD per fornire i topi YFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| With enhanced silver reflective coating-(R77) | OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA) | 055-0010 | With enhanced silver reflective coating-(R77) |
| Fluorescein-dextran | Sigma-Aldrich | FD70 | 70 kDa |
| 0.28 NA, 4x air objective | Olympus Corporation | XLFLUOR 4x/340 | |
| 0.60 NA, 40x air objective | Olympus Corporation | LUCPLFLN | With 0-2 mm coverglass correction |
References
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).
