In vivo Imaging av Deep kortikala lager med en mikroprisma

Summary

Rätvinklig mikroprismor in i musen neocortex möjliggör djup avbildning av flera kortikala skikt med en synpunkt som normalt återfinns i slice. En millimeter mikroprismor erbjuda ett brett fält-of-view (~ 900 mikrometer) och rumslig resolutioner tillräckligt för att lösa Dendritutskotten. Vi visar skikt V neuronala bildbehandling och hjärnbarkens vaskulär avbildning med mikroprismor.

Abstract

Vi presenterar ett protokoll för in vivo avbildning av kortikal vävnad med hjälp av en djupt hjärnröntgen sond i form av en mikroprisma. Mikroprismor är 1-mm i storlek och har en reflekterande beläggning på hypotenusan för att möjliggöra inre reflektion av excitation och utsläpp ljus. Den mikroprisma sonden samtidigt bilder multipla kortikala skikt med ett perspektiv ses vanligtvis bara i bit förberedelser. Bilderna samlas in med ett stort fält-of-view (~ 900 mikrometer). Dessutom ger vi information om icke-överlevnad kirurgiska ingrepp och mikroskop setup. Representativa resultat inkluderar bilder av lager V pyramidal nervceller från Thy-1 YFP-H möss visar deras apikala dendriter som sträcker sig genom det ytliga kortikala lager och sträcker sig in tofsar. Upplösning var tillräckligt för att ryggar bilden dendritiska nära Soma i lagret V nervceller. En svans-ven injektion av fluorescerande färg avslöjar intrikata nätverk av blodkärl i hjärnbarken. Line-scanning av röda blodkroppar (RBC) som flyter genom kapillärerna avslöjar RBC hastighet och flux priser kan erhållas. Denna roman mikroprisma sond är en elegant, men ändå kraftfull ny metod för att visualisera djup cellstrukturer och kortikala funktioner in vivo.

Protocol

Del 1: mikroprisma Optik och Mikroskop Setup

1. Det mikroprismor vi använder är 1-mm, rätvinklig prismor tillverkade av BK7 glas som köpts från Optosigma Corporation (Figur 1). Mikroprismor hanteras med pincetten så är möjligt.
2. Hypotenusan av mikroprisma är belagd med förbättrad silver för att ge en reflexion på mer än 97% från 400 till 2000 nm. Detta ger intern spegling av både laser excitation ljuset och den utsända fluorescensen.
3. Mikroprismor alltid hanteras med pincetten när det är möjligt. Handskar är alltid användas för att hålla prismat rent.
4. Vi använder en specialbyggd två-photon mikroskop kan små djur avbildning. Djuret, fäst vid stereotaktisk enheten är placerad på en motordriven 3-axlig skede.
5. Mikroskopet är ansluten till en Windows PC som kör ScanImage programvara. ScanImage är bilden förvärvet programvara skriven i Matlab genom Pologruto et al ^1.
6. För mikroprisma avbildning samlar vi bilder med en upplösning på 1024 x 1024 eller 512 x 512 pixlar. Dessutom skannar vi vanligtvis på 2 ms / linje eller 4 ms / linje.
7. Två typer av mål som används i experiment:
   • En lägre numeriska bländaröppningen (NA) luft målet för brett fält-of-view imaging (se tabell i Reagenser och utrustning).
   • En högre NA luft mål med ett glas korrigering krage som kan minimera sfäriska avvikelser orsakade av 0 - 2 mm av glas (se tabell i Reagenser och utrustning).
8. När djuret är klar för avbildning i en låg förstoring mål, rikta torget raster scanning mönster av lasern med toppen av mikroprisma. Detta kommer att hjälpa till att orientera bilden och att effektivt utnyttja laserns effekt.
9. Med hjälp av en högre NA-mål med ett glas korrigering krage, som korrigeringen kragen för att korrigera för ca 1 mm av glas. När en fluorescerande bild visas under försöket, kan man nå försiktigt inne i mikroskop för att optimera korrigering kragen för att maximera avbildning upplösning.

Del 2: Icke-överlevnad Animal Kirurgi och mikroprisma Inläggning

1. Hela proceduren längd, från den första snittet till dess att avbildning, beror på målen för försöket. Däremot kan den icke-överlevnad kirurgiska ingrepp och mikroprisma placering förväntas ta cirka 30 - 40 minuter att slutföra.
2. Möss (P30-P60) vägs och bedövas lämpligt att använda en IP injektion av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) till ett plan som lämpar sig för kirurgiska ingrepp.
3. Under hela experimentet bör djuret kontrolleras varje 15-20 minuter för att bedöma nivån av anestesi. Om djuret reagerar på en fast toe-nypa, en extra dos ketamin / xylazin krävs. Vanligtvis en extra dos är en tredjedel av den ursprungliga dosen och kan förberedas i förväg i en spruta för omedelbar IP injektion om det behövs.
4. När musen är ordentligt sövda, är majoriteten av hår på djurets huvud rakat bort med en trimmer med # 40 blad.
5. Nair ® appliceras på kvarvarande hårstrån på huvudet för att hjälpa till att skapa en yta fri från hårstrån som kan komma i vägen för mikroprisma under avbildning. Efter 5 minuter är Nair ® tvättas bort med en bomullspinne.
6. Den sövda djur är korrekt placerad i en mus stereotaktisk enhet. Under kirurgiska ingrepp och sessioner bildbehandling djuret hålls på en vattenfylld-värmedyna inställd på 36 grader Celsius.
7. Med djurets huvud ordentligt fastsatta på plats är ett rent snitt med skalpell ner den mediala raden i skallen att separera huden.
8. En liten mängd 3% väteperoxid är placerad på en bomullspinne och tillämpas på skallen för att rensa bort membran mellan skallen och huden.
9. Den väteperoxid hjälper också till att avslöja bregma, en viktig milstolpe i att veta var man ska utföra kraniotomi och sätt i mikroprisma.
10. Innan kraniotomi startas, är örat barer och bita bar korrekt inställd att luta den exponerade skallen så att det är i princip i nivå med bordet. Detta ger en bättre plattform för kraniotomi. Dessutom gör detta ovansidan av prismat vinkelrät med den inkommande excitation ljus. Detta kommer att hjälpa till att minimera optiska avvikelser medan avbildning.
11. En liten tand Burr (~ 0,8 mm huvud storlek) är anslutet till en Dremel ® verktyg med hjälp av en flexibel förlängning arm. För craniotomies satte vi hastigheten till ungefär 7000 till 10.000 varvtal.
12. Det dentala burr är skummad längs skallen tills en kvadrat spåret är etablerad i benet. Sidorna av torget är ca 2-3 mm lång och centrerad 1,5 mm caudal och 1 mm lateralt bregma.
13. Fortsatt gallring benet tills en liten öppning görs genom skallen. En pincett can Lyft benet luckan bort från skallen.
14. Den Dura måste tas bort innan mikroprisma kan föras in i hjärnbarken. Blödning är bäst kontrolleras genom att låta blodet koagulerar på ytan i flera minuter. Efteråt är det koagulerat blod avlägsnas med ett kirurgiskt svamp innan du sätter i mikroprisma.
15. För att hjälpa underlätta anpassningen av prismat med cortex, är den vertikala ansikte mikroprisma uppradade parallellt med handtag på pincett.
16. Med prismat ordentligt hålls, är hela mikroprisma in tills toppen av prismat är jäms med hjärnbarkens yta.
17. När de sätts på rätt sätt bör mikroprisma kvar i rätt läge. Någon blödning som resultat är minimal och kan absorberas med ett litet kirurgiskt svamp. När prismat är på plats djuret är redo för avbildning.
18. Efter en mikroprisma har använts i ett djur, kan det återanvändas flera gånger. Men det behöver rengöras ordentligt för att avlägsna eventuella kvarvarande biologiskt material. Detta kan uppnås genom att doppa prismat i en liten volym HCl syra, följt av ett dopp i metanol. Den renade mikroprisma kan sedan insvept i linspapper tills framtida användning.

Del 3: representativa resultat

Figur 1: Bilder av rätt vinkel mikroprisma. Prismor används i detta experiment är en millimeter, BK7 glasprismor med en förbättrad silver beläggning på hypotenusan för att möjliggöra inre reflektion av excitation och utsläpp ljus.

Figur 2: Bild av lager V YFP pyramidala nervceller. Brett fält-of-view avbildning med mikroprisma avslöjar en stor population av pyramidal cell organ ~ 800 till 900 ìm djupa från kortikala ytan. Dessutom, jag apikala dendriter som sträcker sig upp mot lager kan också lösas. Skala bar = 200 ìm.

Figur 3: En högre numerisk bländare objektiv som används i samband med mikroprisma tillhandahåller rumsliga upplösningen är tillräcklig för att lösa Dendritutskotten på apikala dendriter på lager V pyramidala nervceller. Skala = 10 mikrometer.

Figur 4: En bild som erhålls med mikroprisma och en svans-ven injektion av fluorescerande färg. Bilden visar vertikal, grovkalibriga fartyg som sträcker sig från djupa delar av hjärnan och mindre kapillärer förgreningar genom kortikala volym. Skala bar = 200 ìm.

Figur 5: Med en högre numerisk bländare mål, kan det nätverk av kapillärer i hjärnbarken avbildas med större detaljrikedom. Skala bar = 50 ìm.

Figur 6: mikroprismor också möjliggör avbildning röda blodkroppar (RBC) som flödar genom fartyg. Röda blodkropparna absorberar inte den fluorescerande färg och därför ses som mörka ränder över hela fartyget. Genom att linje-scanning över fartyget, kan man få mätningar av RBC flux och hastighet. Skala = 10 mikrometer (horisontella fältet i övre och nedre bilden) och 250 ms (lodrätt streck i nedre bilden).

Discussion

Med hjälp av en mikroprisma i en avbildning experiment är relativt enkelt och erbjuder många fördelar för in vivo-studier på neocortex. Representativa exempel att använda denna teknik inkluderar bilder tagna från transgena möss som uttrycker gula fluorescerande protein i lager V kortikala neuroner. Använda mikroprismor kan man se en samling av stora pyramidformade cell organ i lager V, nästan 1 mm under kortikala ytan. Också sett är de apikala dendriter som sträcker sig genom alla de ytliga lagren innan divergerande i tofsar (Figur 2). De möss som används för dessa experiment transgena djur för att uttrycka YFP endast i lager V neuron (YFP-H ^2). Med hjälp av dessa YFP-H möss och en högre numerisk bländare mål med ett glas korrigering krage är det också möjligt att bilden dendriter med större detaljrikedom och lösa Dendritutskotten (Figur 3).

Man kan också märka kortikala blodkärl med en fluorescerande färg som fluorescein-dextran hjälp av etablerade tail-ven injektionsteknik. Typiskt för vuxna möss en 100 ul bolusinjektion av fluorescein-dextran vid 20 mg / ml i fysiologisk koksaltlösning är lämpligt. De bästa resultaten kommer från injicera färgen efter mikroprisma har satts in i hjärnbarken (efter steg 2,16). Med denna teknik kan man se de större kaliber fartyg från djupa lager sträcker sig mot Pia och förgreningar att bilda nätverk av microcapillaries (Figur 4). Denna intrikata nätverk av microcapillaries i hjärnbarken är bäst uppskattas med hjälp av en hög numerisk bländare mål (Figur 5).

Dessutom är det möjligt att mäta röda hastighet blodkroppar och ljuset från djupa hjärnbarkens kapillärer av linje-scanning längs ett fartyg (Figur 6, röda linjen i övre bilden). Eftersom röda blodkroppar inte tar upp de fluorescerande färg, kommer de att visas som mörka ränder. Bilder som är resultatet av en linje-scan har en rumslig dimension i en axel och en tidsdimension i de andra axlarna (Figur 6, botten bild). Från dessa bilder kan man beräkna flöde och hastighet av röda blodkroppar genom kapillär. När det gäller siffran 6 var RBC flux uppmättes till 36 röda blodkropparna / sekund med en hastighet av 0,45 mm / sekund. Detta är i överensstämmelse med resultaten från litteraturen ^3.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
With enhanced silver reflective coating-(R77)	OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)	055-0010	With enhanced silver reflective coating-(R77)
Fluorescein-dextran	Sigma-Aldrich	FD70	70 kDa
0.28 NA, 4x air objective	Olympus Corporation	XLFLUOR 4x/340
0.60 NA, 40x air objective	Olympus Corporation	LUCPLFLN	With 0-2 mm coverglass correction