Summary
Кариотипирование представляет собой простой и полезный метод широко используется для обнаружения генетических изменений. Здесь мы опишем шаг за шагом протокол для распространения хромосомы подготовки человеческих эмбриональных стволовых клеток для мониторинга хромосомной статуса этих клеток поддерживается в культуре.
Abstract
Хотя человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) было показано, что нынешний стабильный кариотип диплоидных 1, многие исследования показали, что в зависимости от условий культивирования они становятся склонны к приобретению хромосомные аномалии, такие как сложение целых или части хромосом. Действительно, при длительном культуры, кариотипическая изменения наблюдаются при ферментативных или химических диссоциации используются 2,3,4, в то время как руководство рассечение колонии для пассирования сохраняет стабильный кариотип 5. Кроме того, изменения в окружающей среде, такие как удаление фидерных клеток также, кажется, идти на компромисс генетической целостности чЭСК 3,6. Как только хромосомные изменения могут повлиять на клеточной физиологии, характеристику генетической целостности чЭСК в пробирке важно учитывая чЭСК в качестве важнейшего инструмента в эмбриогенезе исследования и проверки на наркотики. Кроме того, для будущих терапевтических целях хромосомные изменения реальной проблемой, как это часто связано с канцерогенеза.
Здесь мы показываем, простой и удобный метод для получения высоких спрэдах хромосомы качества для последующего анализа хромосомного набора от G-полосы, FISH, SKY или CGH методы 7,8. Мы рекомендуем проверять хромосомных статус регулярно с интервалом в 5 проходов в целях контроля за появлением транслокации и анеуплоидии
Priscila Бритто и Рафаэла Sartore способствовали в равной степени к бумаге.
Protocol
ОБОРУДОВАНИЕ
- Культуры ткани инкубатор, 37 ° C, 5% СО 2
- Центрифуга
- Набор micropipettors (100, 100 мкл)
- Водяная баня 37 ° С
- Водяная баня 90 ° C должны быть источником водяного пара
- Микроскопа фазового контраста
ПЕРВЫЙ ШАГ
Лечение клеток с колцемид
В этой процедуре мы использовали чЭСК линия H9 культурный на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) инактивированные митомицином С (Sigma) и поддерживается в DMEM/F12 (Invitrogen) с добавлением 20% сыворотки нокаутом замены (KSR, Gibco) и 8ng/mL из фактор роста фибробластов (FGF-2, R & D).
Для того чтобы получить большое количество метафаз распространяется, то рекомендуется использовать культур с высоким митотический индекс, в котором Есть много делящихся клеток.
- Возьмите колбу культуры из инкубатора, а в ламинарного потока, добавить колцемид в конечной концентрации 0,1 мкг / мл.
- Вернуться к колбе инкубатора и подождать 3 часов, так что ингибитор может вызвать митотический арест метафазы, когда хромосомы хорошо конденсируются и могут быть легко визуализированы под микроскопом.
Крепление клетки
- Выньте средних и добавить трипсин / ЭДТА 0,05% достаточно для покрытия поверхности клетки. Разрешить клетки инкубировать 5 минут при комнатной температуре, а затем инактивируют фермент либо путем добавления культуральной среде, содержащей сыворотку или простым добавлением сыворотки в клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы убедиться, что суспензии отдельных клеток достигается получить хорошие распространяется метафазе. - Передача клетки 15 мл центрифужную пробирку и центрифуги на 122 г в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную, оставив около 200 мл, и ресуспендируют гранулы мягко нажимая трубки, как показано на видео. Убедитесь, что клетки хорошо диссоциированных, поэтому вы не можете визуализировать любые сгустки в растворе.
- Далее вам нужно будет добавить 5 мл гипотонического раствора (KCl 75 мм), предварительно нагревают до 37 ° С, медленно, по стенке трубы, как в следующем описании. Сначала добавьте 3 мл, инвертировать трубки в горизонтальное положение просто смешать клетки с гипотонический раствор добавьте оставшиеся 2 мл и согреться при температуре 37 ° С в течение 15 минут.
Примечание: На данном этапе гипотонического раствора приведет к увеличению на клеточном объем и помочь распутать хромосом. Время инкубации очень важно приобрести хороший распространяется хромосоме. Если сроки слишком длинный, клеточная мембрана может лопнуть слишком рано, и хромосомы, будут потеряны. Если слишком короткой, это может быть трудно получить хромосомы распространяется, потому что клеточная мембрана не может нарушить. - Добавить 3 капли фиксирующий раствор (метанол / ледяной уксусной кислоты 3:1), инвертировать трубки осторожно смешать фиксирующий раствор с клетками и центрифуге при 122 г в течение 5 минут без перерыва.
ПРИМЕЧАНИЕ: фиксирующий раствор должен быть свежеприготовленной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать центрифугирование без перерыва, чтобы избежать истощения клетки, предотвращая потерю материала. - Удалите надосадочную, оставив около 200 мл, и ресуспендируют гранулы мягко, нажав в нижней части трубы.
Примечание: Опять же, убедитесь, что клетки хорошо диссоциированных, поэтому вы не можете визуализировать любые сгустки в растворе. - Добавить первых 3 мл фиксирующего раствора, медленно стенки трубы, а при вращении трубки. Обратить трубки в горизонтальное положение просто смешать клетки, а затем добавить еще 2 мл фиксирующего раствора стенки трубы взять клетки вниз. Акций на 4 ° С в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: фиксированные клетки могут храниться в фиксирующий раствор в течение нескольких месяцев при температуре 4 ° C. Помимо защиты клеток в их опухшие государства, фиксирующий раствор удаляет липидов и денатурации белков. Эти события свидетельствуют о клеточной мембраны хрупкой и, как следствие, сделать хромосомы легко распространяется.
Чистка стекол
Перед началом сделать свой распространяется хромосомы убедитесь, что ваши слайды надлежащим образом очищены, или вы можете потерять некоторые ядер, а также метафаз. Этот шаг, а важно, если вы хотите попробовать любую технику гибридизации 9.
- Место слайдов в стакан, содержащий 6M HCl в течение 3 ч при комнатной температуре.
- По истечении этого времени, мыть слайдов в проточной воде в течение 10 минут.
- Промыть слайды в дистиллированной воде и пусть они сохнут при комнатной температуре.
- Теперь слайды можно хранить на 96% этанола и сушат безворсовой непосредственно перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: на месте методы гибридизации, слайды не может храниться более 2-х дней в 96% этаноле
ШАГ ВТОРОЙ
Стиральная клетки
- На следующий день, центрифуги клеток в 122 г в течение 5 минут без перерыва.
- Discard супернатант оставив около 200 мл. Ресуспендируют гранул, аккуратно стряхивая трубки затем добавить 5 мл свежей фиксирующий раствор (метанол / ледяной уксусной кислоты 3:1), медленно стенки трубы при вращении трубы. Повторите этот шаг мыть 2 раза в общей сложности три стирок.
ПРИМЕЧАНИЕ: фиксирующий раствор должен быть свежеприготовленной.
Подготовка слайдов
- На последнем шаге центрифугирования оставить достаточное количество раствора для гомогенизации осадок клеток и получить адекватное количество клеток в слайдах (см. рисунок 1).
- Добавить 20-30 мкл клеточной суспензии на чистую сухую слайд, перемещая пипетку очень близко и параллельно поверхности. Как фиксатором испаряется раствор, поверхность слайд становится зернистым.
- Сразу же, подвергать слайд, лицом вверх, в паром горячей воды (90 °) в течение 30 секунд, чтобы заставить клетки взорвать.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, метанола из фиксатора испаряется решение, в результате чего увеличилась концентрация уксусной кислоты, которые вместе с водой стимулирует хромосомы распространения. - Посмотрите на микроскоп фазового контраста просто проверить, если концентрации, а также распределения клеток хорошо (см. рисунок 1).
- Теперь слайды готовы быть использована для проверки набора хромосом цитогенетики подходы как G-полосы (Гимза), рыба, SKY или CGH.
ВАЖНО СОВЕТЫ
Как выбрать адекватную метафазы, которые будут проанализированы
Выбор круглые и изолированных метафаз (рис. 2D), вы можете избежать рассмотрения ложных анеуплоидии, как получить хромосом, порожденная двумя или более распространяется смешанные вместе или потеря хромосом порожденных запущен хромосоме. Таким образом, избежать выбора метафаз возле ядра, потому что некоторые хромосомы могут быть скрыты от них (рис. 2А и 2В). Кроме того, обратите внимание на круглые метафаз и быть уверенным, что какой-либо хромосомы отделяются от метафазы (рис. 2С).
Устройство подачи клеток и чЭСК кариотип
Для G-диапазонов и SKY анализ, наличие фидерных клеток в культуре чЭСК не мешает результатов, так как фидерных клеток не находятся под деления государства (инактивированные митомицином С или облучения), а не будет частью метафазы населения. Однако для применения FISH технику в интерфазных ядрах, предпочтительно отделить чЭСК населения от фидерных клеток, собирая колонии вручную перед трипсинизации для FISH анализа.
Рисунок 1: Как знать соответствующую плотность клеток в слайдах. Изображения фазового контраста микроскопа в 10 раз цели. (А) плотность клеток слишком высока. Стрелки указывают на метафазных слишком близко ядер. (B), слайд с хорошей плотностью клетки. Кругах шоу метафаз распространяется изолированы от ядра или других метафаз. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
Рисунок 2: Как выбрать адекватную метафазы для анализа. Хромосомы окрашивали DAPI и изображений, полученных в флуоресцентный микроскоп 100x цели. (A) (B) Избегайте метафаз около ядер (показано стрелками) (C) и метафаз не круглая, которые представляют хромосомы разделены (круг). (D) круглый метафазы является хорошим метафазы для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подготовка хромосомы распространяется очень важный шаг для успешного анализа генетического статуса эмбриональных стволовых клеток на регулярной методы, как G-полосы, и более сложные методы, такие как рыбы, и SKY CGH.
Эта процедура может быть применена для многих типов клеток, изменяя период колцемид инкубации, которая зависит от длины клеточного цикла. Для колоний эмбриональных стволовых клеток, мы будем ждать 3 часа, а для эмбриоидных органов (EB) это время может составлять до 6 часов.
В случае работы с клеточными агрегатами (как эмбриоидные тела), вам нужно отделить очень хорошо, чтобы получить единое решение клетки. В этом случае, после трипсина и механической диссоциации, Вы можете воспользоваться фильтром 40 мкм ячейка нейлона (BD Biosciences), а затем дать последовательность процедуры (с шагом 4 из темы процедур).
В процедуре здесь описано, стоит отметить, что суспензии клеток падает "тесно" на слайдах, чтобы избежать чрезмерного распространения хромосом и, следовательно, генерация артефактов.
Мы считаем, что этот протокол является полезной и простой инструмент, который будет регулярно применяться не только в лабораториях дело с эмбриональными стволовыми клетками, но и других исследователей, заинтересованных в изучении хромосомной нестабильности в других стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| Colcemid Karyo MAX | GIBCO, by Life Technologies | 15212-012 | |
| EDTA | Isofar | 721 | |
| Glacial acetic acid | Isofar | 100 | |
| Methanol | Isofar | 208 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck & Co., Inc. | 104.931.000 | |
| Slide | Bioslide | 7105-1 | |
| Tripsin | Sigma-Aldrich | T4799 |
References
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).
- Draper, J. S. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).
- Maitra, A. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).
- Mitalipova, M. M. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).
- Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).
- Caisander, G. Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).
- Imreh, M. P. In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells. J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).
- Robin-Wesselschmidt, J. L. Human Stem Cell Manual. Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. chwartz , Elsevier's Science & Technology Rights. California. 59-59 (2007).
- Rooney, D. E. Human Cytogenetics. , Third Edition, Oxford University Press. (2001).
- Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. Practical in situ hybridization. Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. 51-51 (2000).
