Summary
मानव प्लेटलेट lysate वृद्धि कारकों की एक समृद्ध स्रोत और सेल संस्कृति में एक शक्तिशाली पूरक है. इस प्रोटोकॉल प्लेटलेट अमीर प्लाज्मा से शुरू, कई फ्रीज पिघलना चक्र प्रदर्शन और प्लेटलेट टुकड़े घट द्वारा मानव प्लेटलेट lysate का एक बड़ा पूल तैयार करने की प्रक्रिया को प्रस्तुत करता है.
Abstract
प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक सेल प्रसार कुशलता को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है
Protocol
1. शुरू सामग्री
प्लेटलेट अमीर प्लाज्मा (पीआरपी) cytapheresis द्वारा तैयार या buffy कोट से व्युत्पन्न इकाइयों के साथ शुरू करो.
2. बाँझपन चेक
बाँझपन के लिए प्रत्येक पीआरपी इकाई से एक जुड़ा छोटे बैग (बैक्सटर) मात्रा स्थानांतरित द्वारा 20 एमएल के एक नमूना लेने की जाँच करें. वेल्डिंग द्वारा इस बैग डिस्कनेक्ट.
3. पीआरपी इकाइयों की बर्फ़ीली
तैयारी के तुरंत बाद, पीआरपी इकाइयों फ्रीज नीचे आगे हेरफेर के बिना डिग्री सेल्सियस मूल भंडारण बैग में कम से कम -20.
4. एचपीएल इकाइयों के विगलन
जब जीवाणु परीक्षण नकारात्मक रहे हैं, मानव प्लेटलेट lysate इकाइयों पिघलना, अब 37 ° (जल स्नान) सी जब तक बर्फ के थक्के गायब एचपीएल इकाइयों बुलाया. एचपीएल गर्म मत करो.
5. एचपीएल इकाइयों के pooling
एक प्लेटलेट lysate पूल के लिए कम से कम दस से पंद्रह thawed एचपीएल इकाइयों ले लो करने के लिए एक मानकीकृत उत्पाद तैयार करने के लिए. एचपीएल बैग लगातार पूलिंग डबल बैग (MacoPharma) के लिए और कनेक्ट इन दो बैग में एचपीएल हस्तांतरण. वेल्डिंग द्वारा खाली एचपीएल बैग डिस्कनेक्ट. जमा दो बैग की सामग्री मिश्रण से मानव प्लेटलेट lysate (pHPL) के 3 से 4 एल के अंतिम मात्रा. एक छोटा सा बैग (बैक्सटर) कनेक्ट और जमा उत्पाद के बाँझपन की जांच करने के लिए 20 एमएल pHPL का एक नमूना ले लो. वेल्डिंग द्वारा इस बैग डिस्कनेक्ट.
6. PHPL के Portioning
भाग pHPL आगे प्रसंस्करण के लिए उपयुक्त aliquots. पूलिंग डबल बैग (Macopharma) छोटे बैग (बैक्सटर) कनेक्ट और 250 एमएल ऊपर के संस्करणों छोटे भंडारण बैग (बैक्सटर) को हस्तांतरण. वेल्डिंग के द्वारा भरा बैग डिस्कनेक्ट.
7. पुन pHPL aliquots की ठंड
प्लेटलेट विखंडन की दर और एक कदम आगे / फ्रीज पिघलना द्वारा जारी वृद्धि कारकों की मात्रा बढ़ाएँ. Portioned pHPL के छोटे बैग फिर रुक कम से कम -20 डिग्री सेल्सियस
8. पुन: विगलन और pHPL aliquots के portioning
37 में pHPL बैग पहले गला लें डिग्री सेल्सियस (पानी से स्नान). 50 एमएल शीशियों (फॉकन्स बी) में बाँझ कैंची का उपयोग कर बैग की ट्यूब को काटने और शीशियों में pHPL डालने का कार्य द्वारा सामग्री स्थानांतरण. एक लामिना का प्रवाह बैक्टीरियल या फंगल संक्रमण से बचने की बेंच में इस कदम प्रदर्शन करना.
9. प्लेटलेट टुकड़े का हटाना
प्लेटलेट टुकड़े के रूप में कुल के लिए करते हैं और alloimmunization उत्पन्न हो सकता है, pHPL से उन्हें हटा दें. PHPL शीशियों इसलिए अपकेंद्रित्र 4,000 g (15 मिनट, 4 ° C). एक लामिना का प्रवाह बेंच विंदुक में अंतिम भंडारण शीशियों (फॉकन्स बी) में सतह पर तैरनेवाला प्लाज्मा और प्लेटलेट छर्रों त्यागें सेल संस्कृति में टुकड़े से बचने के लिए.
10. PHPL का भंडारण
50 एमएल pHPL शीशियों की aliquots फिर रुक कम से कम 20 डिग्री सेल्सियस और उन्हें प्रयोगात्मक उपयोग के लिए दुकान.
11. सेल संस्कृति में pHPL का प्रयोग
प्रारंभ में मध्यम परिरक्षक - मुक्त हेपरिन जोड़ने के लिए जेल के गठन से बचने के. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक pHPL विभाज्य पहले गला लें और 8 के अलावा द्वारा संस्कृति के माध्यम के पूरक - 10%.
माध्यमों
एमएससी - मध्यम:
एक सदस्य के 500 एमएल का प्रयोग करें, thawed pHPL के 56 एमएल (देखें भी अधिक जानकारी के लिए एक संदर्भ) और 2 आइयू / एमएल (= शेयर समाधान के μl 224) (के clumping के माध्यम से मध्यम की जमावट से बचा जाता परिरक्षक मुक्त हेपरिन के जोड़ प्लाज्मा में फाइब्रिनोजेन) 10% pHPL की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए. इसके अतिरिक्त पेनिसिलिन (100U/mL) / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100μg/mL) समाधान और एल Glutamin के 2mm (दोनों सिग्मा) जोड़ें.
एक 20 सुक्ष्ममापी ताकना आकार वैक्यूम फिल्टर (Millipore) के माध्यम से मध्यम फ़िल्टर. बोतल उचित लेबल (सामग्री, तिथि,).
ECFC - मध्यम:
EBM (500 एमएल) की एक बोतल का उपयोग करें, साइटोकाइन aliquots, परिरक्षक मुक्त हेपरिन की 56 एमएल pHPL, 10 आइयू / एमएल (= 1120μl शेयर समाधान के), (100U/mL) पेनिसिलीन / (स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 जोड़ने के छ / एमएल) समाधान और एल Glutamin के बेसल और मध्यम फिल्टर करने के लिए एक 20 μl ध्यान में लीन होना आकार वैक्यूम फिल्टर (Millipore) के साथ 2mm. बोतल उचित लेबल (सामग्री, तिथि,).
चित्रा 1: एक स्थानीय रक्त बैंक या किसी अन्य अधिकृत प्रदाता से एक पूरी रक्तदान से प्लेटलेट अमीर प्लाज्मा की तैयारी. Centrifugation के बाद रक्त प्लाज्मा, buffy कोट और लाल रक्त कोशिकाओं में विभाजित किया जा सकता है है. चार buffy कोट इकाइयों, रक्त समूह ओ और एक रक्त समूह अटल बिहारी प्लाज्मा पहले centrifugation प्लेटलेट अमीर प्लाज्मा अलग करने के लिए जमा किया जा सकता है है. एक नियमित रूप से गुणवत्ता प्लेटलेट अमीर लगभग 300ml के प्लाज्मा इकाई एमएल या 3x10 platele 11 प्रति 1x10 9 प्लेटलेट्स शामिल करना चाहिएटीएस कुल.
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Discussion
कुछ क्षेत्रों में प्लेटलेट अमीर प्लाज्मा (पीआरपी) buffy कोट अन्यथा पैक परीक्षण रक्त दान (चित्रा 1) से लाल रक्त कोशिका के उत्पादन की बर्बादी उत्पाद से प्राप्त किया जा सकता है. बेहतर, पीआरपी तुरंत pHPL के आगे की तैयारी के लिए प्रयोग किया जाता है, के रूप में पुरानी प्लेटलेट में वृद्धि कारकों की उपलब्धता ध्यान केंद्रित प्लेटलेट भंडारण घावों और 20 गिरावट की वजह से कम किया जा सकता है. यह आगे प्लाज्मा के साथ एबी रक्त वर्ग के रक्त समूह ओ के प्लेटलेट्स मिलान ABH प्रतिजनों और isoagglutinins के संभावित प्रभावों से बचने के द्वारा पीआरपी उत्पादन की सिफारिश की है. अब तक, सेल संस्कृतियों ज्यादातर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) का इस्तेमाल किया है जो 21 xenoimmunization और ज्ञात और अज्ञात रोगजनकों के संचरण के जोखिम भालू. ऑटोलॉगस सीरम या सीरम मुक्त मीडिया जैसे वैकल्पिक कई अनुप्रयोगों में FBS जगह में अभी तक सफल नहीं किया अध्ययन में पिछले 22 हम mesenchymal stromal कोशिकाओं के सेल प्रसार में pHPL की एक उच्च दक्षता का खुलासा विस्तार पर pHPL और FBS के प्रभाव की तुलना में है. 7,8,23 ईजीएम-2 में पशु सीरम मुक्त pHPL साथ पूरक शर्तों के तहत endothelial पूर्वज कोशिकाओं के अलगाव और बड़े पैमाने पर विस्तार Reinisch एट द्वारा दिखाया गया है . 11 अल. और आगे निकोल ए Hofmann द्वारा एक जौव प्रोटोकॉल के रूप में प्रस्तुत किया है. एमएससी और ECFC मध्यम तैयारी की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल आंकड़े 2 और 3 में वर्णित हैं.
FBS के लिए एक शक्तिशाली विकल्प के रूप में pHPL का उपयोग एक जानवर सीरम मुक्त अच्छा विनिर्माण अभ्यास की दिशा में एक आकर्षक कदम (जीएमपी) अनुरूप नैदानिक आवेदन के लिए सेल चिकित्सा विज्ञान के विकास का प्रतिनिधित्व करता है 9,24.
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Acknowledgments
यह काम ऑस्ट्रिया रिसर्च फाउंडेशन (FWF, अनुदान डी एस के लिए N211 - नेन) और ऑस्ट्रिया अनुसंधान संवर्धन एजेंसी (FFG, अनुदान डी एस के लिए N200) द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों के उत्कृष्ट तकनीकी और भाषाई संपादन के लिए सहायता मोनिका Farrell के लिए क्लौडिया यूआरएल धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double bag (2 x 3.5L) | MacoPharma | VDL 8000XQ | originally for ascites puncture |
| 50 mL Falcon tube | Falcon BD | 2098 | |
| 50 mL Stripettes | Costar | 4501 | |
| Plasma bags (600mL) | Baxter Internationl Inc. | R4R2021 | |
| Sterile tubing welder | Terumo Medical Corp. | TSCD-II | |
| Welding equipment | Fresenius Kabi | Compo Seal | |
| Water bath | |||
| Sterile scissors | |||
| Clamps | |||
| Centrifuge |
References
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Repair Regen. 16, 585-601 (2008).
- Giacco, F. Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1. FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).
- Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25, 1270-1278 (2007).
- Kakudo, N. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 122, 1352-1360 (2008).
- Doucet, C. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: A safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 205, 228-236 (2005).
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum Tissue Eng Part. C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Lange, C. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, 18-26 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Bernardo, M. E. Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. J Cell Physiol. 211, 121-130 (2007).
- Carrancio, S. Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification. Exp Hematol. 36, 1014-1021 (2008).
- Muller, A. M. Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue. Tissue Eng Part A. 15, 869-875 (2009).
- Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., Andia, I. The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields. Biomaterials. 28, 4551-4560 (2007).
- Anitua, E. New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies. Trends Biotechnol. 24, 227-234 (2006).
- Martinez-Zapata, M. J. Efficacy and safety of the use of autologous plasma rich in platelets for tissue regeneration: a systematic review. Transfusion. 49, 44-56 (2009).
- Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Craniomaxillofac Surg. 30, 97-102 (2002).
- Frechette, J. P., Martineau, I. &, Gagnon, G. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing. J Dent Res. 84, 434-439 (2005).
- Seghatchian, J., Krailadsiri, P.
- Selvaggi, T. A., Walker, R. E., Fleisher, T. A. Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions. Blood. 89, 776-779 (1997).
- Tonti, G. A., Mannello, F. From bone marrow to therapeutic applications: different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera. Int J Dev Biol. 52, 1023-1032 (2008).
- Bieback, K. Human Alternatives to Fetal Bovine Serum for the Expansion of Mesenchymal Stromal Cells from Bone Marrow. Stem Cells. , (2009).
- Rohde, E., Schallmoser, K., Bartmann, C., Reinisch, A. GMP-Compliant Propagation of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Regulations and Quality. Gad, S. C. , John Wiley and Sons, Inc. 97-115 (2008).
