Summary
L'ultracentrifugation analytique (AUC) de cellules de l'échantillon et le tampon de l'échantillon détient référence et au cours d'expériences et est exposé à vide élevé et des vitesses de rotor jusqu'à 60.000 rpm. Cette vidéo va démontrer le souci du détail nécessaire pour l'assemblage, le chargement et l'alignement de cette composante très importante d'une expérience ASC.
Abstract
L'ultracentrifugation analytique (AUC) est un outil puissant biophysiques qui nous permet d'enregistrer des profils de sédimentation macromoléculaires pendant la centrifugation à grande vitesse. Lorsqu'il est correctement planifié et exécuté, une vitesse de sédimentation ou de l'expérience ASC équilibre de sédimentation peut révéler beaucoup de choses sur une protéine en ce qui concerne la taille et la forme, la pureté de l'échantillon, coefficient de sédimentation, les Etats oligomérisation et interactions protéine-protéine.
Cette technique, cependant, exige un niveau d'attention rigoureuse technique. Exemple de cellules détenir une pièce maîtresse sectorisé en sandwich entre deux assemblées fenêtre. Ils sont scellés avec une pression d'environ 120-140 couple in / lbs. Tampon de référence et l'échantillon sont chargés dans les secteurs central et puis après d'étanchéité, les cellules sont alignées avec précision dans un rotor en titane afin que les systèmes de détection optique de balayage à la fois l'échantillon et le tampon de référence dans la ligne médiane trajet radial même à travers chaque secteur central tout en tournant à des vitesses allant jusqu'à 60 000 tours par minute et sous vide très poussé
Non seulement est bon assemblage de cellules de l'échantillon critiques, composants de la cellule de l'échantillon sont très chers et doivent être correctement pris en charge afin de s'assurer qu'ils sont en état de marche optimal afin d'éviter les fuites et les bris lors des expérimentations. Manipuler les fenêtres soigneusement, pour la moindre fissure ou éraflure peut conduire à la rupture dans la centrifugeuse. Le contact entre centre et fenêtres doivent être aussi serrée que possible, c'est à dire les anneaux de Newton ne s doit être visible après une pression de couple est appliqué. La poussière, les peluches, les rayures et les huiles soit sur les fenêtres ou la pièce maîtresse tout compromis ce contact et peut très facilement conduire à des fuites de solutions d'un secteur à un autre ou une fuite hors de la pièce tous ensemble. Non seulement les précieux échantillons perdus, les fuites de solutions lors d'une expérience va provoquer un déséquilibre de pression dans la cellule qui conduit souvent à des vitres brisées et maîtresses. En outre, les joints et bouchons branchez le logement doit être solidement en place pour éviter les solutions étant retirée du secteur de la pièce à travers les trous de chargement par le haut vide dans la chambre de centrifugation. Doublures de fenêtres et les joints doivent être exempts de ruptures et les fissures qui pourraient causer des mouvements qui en résultent vitres brisées.
Cette vidéo va montrer nos procédures d'assemblage de cellules de l'échantillon, le couple, le chargement et l'alignement du rotor pour aider à minimiser les dommages composante, la solution de fuites et de bris lors de l'expérience parfaite AUC.
Protocol
Assemblée cellule d'échantillon et de couple
- Nous commençons la construction de cellules de l'échantillon en mettant ensemble deux assemblées fenêtre.
Placer un joint de fenêtre dans le porte-fenêtre. Positionner le revêtement fenêtre (ou il est parfois appelé un coussin fenêtre) à l'intérieur du porte-fenêtre de sorte que l'ouverture de la doublure est en face de la rainure du support. Avec un léger angle, placer la fenêtre dans le support alignant la marque gravée sur la fenêtre avec la manière clé de la porte-fenêtre. Appuyez doucement sur les bords mêmes sur les deux côtés de la fenêtre. - Pour assurer une bonne étanchéité et un couple précis de la cellule d'échantillon, nous enduire légèrement le joint du boîtier et l'anneau à vis avec un lubrifiant Spinkote. Étaler une très petite quantité de Spinkote entre votre pouce et votre index. Enduire le filetage bague de vis avec une fine pellicule invisible de Spinkote. De même, le manteau le joint du boîtier. Essuyer tout lubrifiant visible.
- Commencez l'assemblage de cellules de l'échantillon en faisant glisser un assemblage de la fenêtre, avec la fenêtre tournée vers vous, dans le logement de pile en alignant la rainure avec la clé de logement. Aligner la rainure avec la clé de voûte de logement et le laisser tomber doucement sur le dessus de l'assemblage de la fenêtre à l'intérieur de la cellule.
- Ne pas utiliser n'importe quelle sorte d'outil pour pousser la pièce maîtresse dans le boîtier de la cellule. Cela pourrait causer des dommages permanents au CP résultant de fuites au cours des expériences. Tourner l'assemblage deuxième fenêtre pour que la fenêtre est orientée vers la pièce, loin de vous, aligner clavetage avec les principaux logement et faites-le glisser sur le dessus de la pièce. Placer un joint de logement sur le dessus, puis, un anneau à vis de sorte que le mot «Out» est visible. En utilisant vos doigts et un outil d'alignement, la main serrer la bague à vis.
Si le CP ne glisse pas facilement dans le canon de logement, d'abord l'aligner, alors, de placer l'ensemble deuxième fenêtre sur le dessus de celui-ci. En appliquant une légère pression à la baisse sur l'assemblage de la fenêtre, faites glisser la fois dans le boîtier de la cellule dans le même temps. De cette façon, nous évitons appuyant directement sur le PC.
C'est maintenant le bon moment pour regarder à l'intérieur de la cellule pour la poussière, les peluches et les empreintes digitales. Vous remarquerez également que les anneaux de Newton indiquent qu'il ya encore de l'air entre le CP et les fenêtres. Celles-ci disparaissent après application d'un couple. - Avec la bague à vis et le mot «out» visibles, lieu de la cellule de l'échantillon tout en bas à l'intérieur du couple de serrage des cellules du stand de couple. Tenir la cellule en place en appliquant une pression constante sur la poignée se couple. Dans un mouvement continu, serrer la bague à vis à entre 120 à 140 lb-po. Si vous utilisez une clé micrométrique réglable en couple, il réglé entre 120-140 po / lb et serrer la bague à vis jusqu'au Clé "clics" en indiquant le couple réglé est atteint. Relâchez la poignée se couple et enlevez soigneusement la cellule de l'échantillon sans toucher les fenêtres.
Chargement et d'étanchéité de la cellule échantillon
- Pour les expériences vitesse de sédimentation, nous avons l'habitude de charger un volume de 400ul dans chaque secteur de la pièce de 12mm avec une pipette 200ul. Position de la cellule de l'échantillon avec les trous de chargement sur le dessus et le mot "out" sur l'anneau de vis apparentes. Glissez la façon la pipette moitié pointe vers le bas dans le secteur central gauche à travers les trous de chargement et lentement se dispenser 200ul de solution de référence. Répéter une fois au total 400ul. Utiliser le même embout de pipette et la même technique, soigneusement et lentement remplissez le secteur central DROITE avec 400ul de solution d'échantillon.
Les volumes de 150-180 ul sont utilisés pour des expériences de l'équilibre de sédimentation, mais le même soin et la technique doivent être suivies.
Il est impératif de correspondre aux volumes des solutions de référence et l'échantillon le plus fidèlement possible. Montage de la pointe de la pipette fermement sur la pipette, lentement chargement et la distribution de solutions, en évitant les bulles de chargement et en utilisant le même embout de pipette pour les deux solutions ensemble de l'aide à maintenir les volumes aussi égaux que possible. - Sceau de la cellule en plaçant deux nouveaux joints rouges prise logements parfaitement dans chaque trou de chargement en s'assurant qu'ils sont placés entre la pièce maîtresse et le boîtier en aluminium. Couvrir avec une fiche de chaque logement. Serrer à la main avec un tournevis à tête plate de petite taille.
Alignement de cellules des échantillons dans Rotor
- Avant de charger le rotor, assurez-vous que le contrepoids ne dépasse pas 0,5 g de moins que la cellule d'échantillon dans la position inverse, en cas que les fuites de cellules de l'échantillon. Commencez avec le solde à zéro. D'abord peser les cellules de l'échantillon qui sera en position face à la CB. Remettre la balance à soustraire le poids de cellules de l'échantillon, puis, de peser le CB. Ajouter ou soustraire le poids du trou de fixation du contrepoids. Assurez-vous que les poids ne dépassent pas du haut. Repeser pour s'assurer que le poids de contrebalancer finale est dans 0,5 g de moins que la cellule d'échantillon opposé.
- L'utilisation d'un rotor de 4-lieu, placer le contrepoids en position 4, de sorte que la flèche blanche est visible et pointant en tIl direction de la force centrifuge. Assurez-vous que c'est tout le chemin jusqu'à l'intérieur du rotor. Doucement fixez la vis de réglage, a trouvé au sommet de la contrebalancer juste en face de la flèche blanche, jusqu'à ce que le contrepoids est bien en place, mais encore capable d'être aligné. Position de la cellule échantillon équilibré avec le boîtier se branche en face du centre du rotor et le mot "out" sur l'anneau de vis apparentes.
- En regardant par-dessous le rotor, aligner la marque tracée à l'intérieur (la marque la plus proche du centre du rotor) avec la marque gravée sur le contrepoids à l'aide d'un outil d'alignement. Serrer la vis de réglage pour verrouiller contrebalancer aligné en place. De la même façon, aligner la marque tracée échantillon de cellules avec la marque tracée à l'intérieur à la position 2 sur le rotor.
Pour plus d'informations, voir https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Discussion
L'ensemble de la cellule appropriée, l'insertion de l'échantillon, et l'alignement des cellules dans le rotor est critique pour haute expériences ASC qualité. Cela est vrai, en particulier, pour des expériences qui nécessitent une analyse très détaillée des données acquises sur les profils de sédimentation macromoléculaires, par exemple, lorsque l'on étudie les interactions entre protéines et de déterminer les montants globaux de trace. Souvent, la qualité de l'installation expérimentale est la limitation de l'exactitude et la précision des résultats de l'étude des AUC. Pour plus de détails sur la conception pratique et l'exécution des expériences d'autres AUC, voir Références 1 - 3. Ateliers pratiques couvrant l'installation, la théorie et l'analyse de données d'expériences AUC sont détenus deux fois par an dans notre laboratoire à l'Institut National de la Santé [4].
Acknowledgments
Nous reconnaissons l'appui à la recherche par le Programme de recherche intra-muros des NIBIB, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Cell Housing kit | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Window gasket | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Window, sapphire | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Window, quartz | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Window holder | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Cell housing plug | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
