Summary
Die analytischen Ultrazentrifuge (AUC) Probenzelle hält Probe und Referenz-Puffer und während der Experimente und eine hohe Vakuum-und Rotor-Geschwindigkeiten von bis zu 60.000 Umdrehungen pro Minute ausgesetzt. Dieses Video startet den viel Liebe zum Detail, die für Montage, Be-und Ausrichtung dieses sehr wichtige Komponente einer AUC Experiment demonstrieren.
Abstract
Die analytischen Ultrazentrifuge (AUC) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das uns biophysikalischen makromolekulare Sedimentation Profile während Hochgeschwindigkeitszentrifugation aufnehmen können. Wenn sie richtig geplant und ausgeführt, kann ein AUC Sedimentationsgeschwindigkeit oder Sedimentationsgleichgewicht Experiment sehr viel über ein Protein in Bezug auf Größe und Form, Muster Reinheit, Sedimentationskoeffizient, Oligomerisierung Staaten und Protein-Protein-Wechselwirkungen zeigen.
Diese Technik erfordert jedoch eine strenge Niveau der technischen Aufmerksamkeit. Beispiel Zellen Besitz eines sectored Kernstück zwischen zwei Glasscheiben eingeschlossen. Sie sind mit einem Drehmoment Druck von etwa 120-140 in / lbs versiegelt. Referenz-Puffer und Probe werden in den Mittelpunkt Sektoren geladen und dann nach der Versiegelung werden die Zellen genau in einem Titan-Rotor so ausgerichtet, dass die optische Detektion Systeme scannen beide Probe und Referenz-Puffer in der gleichen radialen Weg Mittellinie durch jede Herzstück Sektor während der Rotation bei Geschwindigkeiten von bis zu 60 000 Umdrehungen pro Minute und unter sehr hohem Vakuum
Nicht nur ist die richtige Probenzelle Montage kritisch sind Probenzelle Komponenten sehr teuer und muss richtig gepflegt werden, um sicherzustellen, dass sie in optimale Arbeitsbedingungen Voraussetzung, um Lecks und Brüche während der Experimente zu vermeiden. Handle Fenster sorgfältig, denn selbst die kleinste Riss oder Kratzer zu einem Bruch in der Zentrifuge führen kann. Der Kontakt zwischen Kernstück und Fenster müssen so dicht wie möglich, dh keine Newton s Ringe sichtbar sein soll, nachdem Drehmoment Druck ausgeübt wird. Staub, Flusen, Kratzer und Öle entweder auf die Fenster oder das Herzstück aller Kompromisse diesen Kontakt und kann sehr einfach an der undichten Lösungen von einem Sektor zum anderen oder ein Auslaufen der Mittelpunkt allen zusammen zu führen. Nicht nur die wertvollen Proben verloren, Auslaufen von Lösungen während eines Experiments wird ein Ungleichgewicht der Druck in der Zelle führt oft zu Glasbruch und Mittelstücke verursachen. Darüber hinaus müssen Plug Dichtungen und Gehäuse Stecker fest an seinem Platz, um Lösungen Herausziehen des Mittelstücks Sektor durch die Be-Löcher durch das Hochvakuum in der Zentrifugenkammer zu vermeiden. Fenster-Liner und Dichtungen müssen frei von Brüchen und Rissen dazu führen, dass Bewegung die sich in zerbrochenen Fenstern konnte.
Dieses Video wird unser Verfahren der Messküvette Montage zu demonstrieren, zu minimieren Drehmoment, Be-und Rotor-Ausrichtung, um Komponenten beschädigt, Lösung undicht und Bruch während des perfekten AUC Experiment.
Protocol
Messkammerdirektanschluss Montage und Drehmoment
- Wir beginnen Probenzelle Konstruktion, indem sie zusammen 2 Fenster Baugruppen.
Legen Sie ein Fenster Dichtung in das Fenster Halter. Positionieren Sie die Fenster-Liner (oder ist es manchmal ein Fenster Kissen genannt) in das Fenster Halter, so dass die Öffnung der Liner ist gegenüber der Nut des Halters. In einem leichten Winkel, statt das Fenster in die Halterung Ausrichten der Anriss auf das Fenster mit den wichtigsten Weg des Fensters Inhaber. Drücken Sie vorsichtig an den Rändern auf beiden Seiten des Fensters. - Um eine einwandfreie Abdichtung und genaue Drehmoment des Probenzelle zu gewährleisten, haben wir leicht Beschichtung der Gehäuse-Dichtung und die Schraube mit Spinkote Schmiermittel. Verteilen Sie eine sehr kleine Menge von Spinkote zwischen Daumen und Zeigefinger. Bestreichen Sie die Schraubring Gewinde mit einem dünnen, unsichtbaren Film von Spinkote. Ebenso Beschichtung der Gehäuse-Dichtung. Wischen Sie alle sichtbaren Schmiermittel.
- Begin Probenzelle Montage indem Sie ein Fenster Montage, mit dem Fenster nach oben in Richtung zu Ihnen, in die Zelle Gehäuse, indem Sie die Nut mit dem Gehäuse drücken. Richten Sie den Mittelpunkt Keilnut mit dem Gehäuse gedrückt und lassen Sie ihn sanft auf der Oberseite des Fensters Montage im Inneren der Zelle fallen.
- Verwenden Sie niemals irgendeine Art von Werkzeug, um das Herzstück in die Zelle Gehäuse schieben. Dies könnte zu irreparablen Schäden an den CP was Leck während der Experimente. Schalten Sie das zweite Fenster Montage, so dass das Fenster in Richtung Zentrum vor, weg von dir, Nut auszurichten Gehäuse gedrückt und schieben Sie ihn nach unten auf den Mittelpunkt. Legen Sie ein Gehäuse Dichtung oben, dann ein Schraubring so das Wort "Out" zu sehen ist. Benutzen Sie Ihre Finger und ein Alignment-Werkzeug, ziehen Sie den Schraubring.
Wenn der CP nicht leicht in das Gehäuse Barrel, erst ausrichten, dann legen Sie das zweite Fenster Montage oben drauf. Durch die Anwendung sanften Druck auf das Fenster Montage, schieben beide in die Zelle Gehäuse zur gleichen Zeit. Auf diese Weise vermeiden wir drücken direkt auf den CP.
Jetzt ist ein guter Zeitpunkt, um innerhalb der Zelle für Staub, Flusen und Fingerabdrücken zu suchen. Sie werden auch feststellen Newtonsche Ringe, dass es noch Luft zwischen den CP und die Fenster anzuzeigen. Diese werden nach dem Auftragen Drehmoment verschwinden. - Mit dem Schraubring und das Wort "out" zu sehen, statt die Probenzelle den ganzen Weg hinunter in die Zelle Drehmoment Spannzange des Drehmoments stehen. Halten Zelle statt, indem konstanten Druck auf das Drehmoment stehen zu behandeln. In einer kontinuierlichen Bewegung, ziehen Sie die Schraube Ring zwischen 120-140 in-lbs. Bei Verwendung eines einstellbaren Mikrometer Drehmomentschlüssel, setzen Sie ihn auf zwischen 120-140 in / lbs und die Schraube anziehen Ring, bis der Schlüssel "Klicks" zeigt das eingestellte Drehmoment erreicht ist. Lassen Sie die Drehmoment stehen Griff und entfernen Sie vorsichtig die Probenzelle, ohne das Fenster.
Be-und Sealing die Messküvette
- Für Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente, die wir routinemäßig laden ein Volumen von 400ul in jedem Sektor des 12mm Mittelstück mit einem 200 &mgr; l Pipette. Position der Messzelle mit dem Laden Löcher auf der Oberseite und das Wort "out" auf dem Schraubring sichtbar. Schieben Sie die Pipettenspitze auf halbem Weg nach unten in den LINKS Herzstück Sektor durch die Be-Löcher und langsam verzichten 200 &mgr; l der Referenzlösung. Wiederholen Sie einmal, um 400ul insgesamt. Mit der gleichen Pipettenspitze und die gleiche Technik, vorsichtig und langsam füllen Sie die RECHTE Herzstück Sektor mit 400ul der Probenlösung.
Volumes von 150-180 ul für Sedimentationsgleichgewicht Experimenten verwendet, aber der gleichen Sorgfalt und Technik sind zu beachten.
Es ist zwingend notwendig, um das Volumen der Referenz und Probe-Lösungen passen so genau wie möglich. Montage der Pipettenspitze fest auf die Pipette langsam geladen und Abgabe-Lösungen, die Vermeidung loading Blasen und mit der gleichen Pipettenspitze für beide Lösungen alle Beihilfen im Sinne der Volumina möglichst gleich. - Seal die Zelle, indem Sie 2 neue rot-Gehäuse-Stecker Dichtungen fest in jeder Be-Loch dafür, dass sie zwischen dem Mittelstück und dem Aluminium-Gehäuse positioniert sind. Abdeckung mit jeweils einem Gehäuse anschließen. Hand mit einem kleinen flachen Schraubendreher anziehen.
Messkammerdirektanschluss Alignment in Rotor
- Vor dem Einlegen des Rotors, stellen Sie sicher, das Gegengewicht ist nicht mehr als .5 g leichter als die Probenzelle in die entgegengesetzte Position für den Fall, dass Probenzelle Lecks. Beginnen Sie mit der Balance bei Null. Zunächst wiegen die Probe Zelle, in der Position gegenüber der CB werden. Tarieren die Probenzelle Gewicht subtrahieren, dann wiegen die CB. Addieren oder Subtrahieren von Gewicht aus dem Befestigungsloch der Ausgleich. Stellen Sie sicher, Gewichte nicht von oben ragen. Erneut gewogen, um sicherzustellen, dass das Gegengewicht Endgewicht innerhalb .5 g leichter ist als das Gegenteil Probenzelle.
- Mit einem 4-fach Rotor, statt das Gegengewicht in Position 4, so dass der weiße Pfeil sichtbar ist und verweist in ter Richtung der Zentrifugalkraft. Stellen Sie sicher, es ist den ganzen Weg hinunter in den Rotor. Vorsichtig ziehen Sie die Stellschraube, auf der Oberseite des Gegengewicht direkt gegenüber dem weißen Pfeil gefunden, bis das Gegengewicht fest an seinem Platz, aber immer noch in der Lage, ausgerichtet werden. Position der ausgewogenen Probenzelle mit dem Gehäuse Stecker vor der Mitte des Rotors und das Wort "out" auf dem Schraubring sichtbar.
- Blick von unterhalb des Rotors, richten Sie die Innenseite Anriss (die Marke am nächsten an der Mitte des Rotors) mit dem Anriss auf das Gegengewicht mit einem Alignment-Tool. Ziehen Sie die Stellschraube ausgerichtet Gegengewicht zu verriegeln. In der gleichen Weise, richten Sie die Probenzelle Anriss mit der Innenseite Anriss an Position 2 auf dem Rotor.
Für weitere Informationen siehe https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Discussion
Die richtige Zellverband, Probe Insertion und Ausrichtung der Zellen in der Rotor ist entscheidend für die hohe Qualität AUC Experimente. Dies gilt insbesondere für Experimente, die eine sehr detaillierte Analyse der erfassten Daten über die makromolekulare Sedimentation Profile erfordern, z. B. beim Studium Protein-Interaktionen und die Bestimmung Spur Gesamtbeträge. Oft ist die Qualität der Versuchsaufbau ist für die Genauigkeit und Präzision der Ergebnisse aus der AUC Studie begrenzen. Für Einzelheiten über die praktische Design und die weitere Ausführung des AUC Experimente finden Sie unter Referenzen 1 bis 3. Workshops zu den praktischen Aufbau, Theorie und Datenanalyse von AUC Experimente werden zweimal im Jahr in unserem Labor an der National Institutes of Health [4].
Acknowledgments
Wir erkennen die Unterstützung der Forschung durch die Interne Research Program der NIBIB, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Cell Housing kit | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Window gasket | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Window, sapphire | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Window, quartz | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Window holder | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Cell housing plug | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
