Summary
Analitik ultrasantrifüjdeki (EAA) örnek hücre örnek ve referans tampon ve deneyler sırasında tutar ve yüksek vakum ve 60.000 rpm rotor hızlarına maruz kalmaktadır. Bu video EAA bir deney bu çok önemli bir bileşeni montaj, yükleme ve uyum için gerekli ayrıntısına kadar titiz bir dikkat gösterecektir.
Abstract
Analitik ultrasantrifüjdeki (EAA), bize yüksek hızda santrifüj sırasında makromoleküler sedimantasyon profilleri kaydetmenize olanak verir bir güçlü biyofiziksel bir araçtır. Düzgün bir şekilde planlandığı ve yürütüldüğü, EAA sedimantasyon hızı veya sedimantasyon denge deneyi bir boyut ve şekil bakımından protein, örnek saflığı, sedimantasyon katsayısı, oligomerization devletler ve protein-protein etkileşimleri hakkında çok şey ortaya çıkarabilir.
Bu teknik, ancak sıkı bir düzeyde teknik dikkat gerektirir. Örnek hücreleri iki pencere meclisleri arasında sıkışmış bir sectored merkezi parçası tutun. Onlar / lbs yaklaşık 120-140 tork basıncı ile mühürlenir. Hızlarda dönerken optik algılama sistemleri, her merkezinde sektör kanalıyla aynı radyal yolu orta hat örnek ve referans tampon tarama Referans tampon ve böylece örnek merkezinde sektörleri içine yüklenir ve sonra sızdırmazlık sonra, hücrelerin tam bir titanyum rotor hizalanır 60, 000 rpm ve çok yüksek vakum altında
Sadece uygun örnek hücre montaj kritik, örnek hücre parçaları çok pahalı ve deneyler sırasında kaçak ve kırılmaları önlemek için en iyi çalışma koşullarını sağlamak için dikkat edilmesi gerekir. Hatta en ufak bir çatlak veya çizik santrifüj kırılmaya neden olabilir, dikkatli bir şekilde pencereler taşıyınız. Merkezinde ve pencereler arasında iletişim mümkün olduğunca sıkı olmalıdır; tork basınç uygulandıktan sonra, yani hiçbir Newton halkaları görünür olmalıdır. Toz, tüy bırakmayan, çizilmelere ve windows veya merkezinde tüm bu iletişim uzlaşma ve ya yağlar çok kolay bir sektörün başka bir çözüm sızıntı ya da merkezinde hep birlikte dışarı sızdıran yol açabilir. Değerli örnekleri bir deney sırasında çözümleri ile ilgili sızan bilgiler, kayıp, camları kırık ve centerpieces sık sık yol açan hücre basınç bir dengesizlik neden kalmaz. Buna ek olarak, fiş contalar ve konut fişler santrifüj odasında yüksek vakum yükleme deliklerden merkezinde sektörünün çıkardı çözümler önlemek için güvenli olmalıdır. Pencere gömlekleri ve contalar, hareket, kırık pencereleri neden olabilir tatili ve çatlaklar ücretsiz olmalıdır.
Bu video örnek hücre montaj prosedürleri göstermek, yardımcı olmak için tork, yükleme ve rotor hizalama bileşeni, mükemmel bir EAA deney sırasında hasar, sızıntı çözüm ve kırılmaları en aza indirir.
Protocol
Örnek Hücre Montaj ve Tork
- Biz birlikte 2 pencere meclisleri koyarak örnek hücre yapısı başlar.
Pencere tutucu bir pencere conta yerleştirin. Pozisyon gemisi açılış sahibinin kaması karşısında pencere pencere tutucu içinde astar (ya da bazen bir pencere yastık denir) böylece. Hafif bir açıyla, pencere pencere pencere sahibinin anahtar yolu ile katip işareti hizalayarak tutucuya yerleştirin. Pencerenin her iki tarafta çok kenarlarına hafifçe bastırın. - Uygun sızdırmazlık ve örnek hücrenin doğru tork sağlamak için, biz hafifçe kat Spinkote yağ ile konut conta ve vida halkası. Spinkote başparmak ve işaret parmağı arasında çok küçük bir miktar sürün. Spinkote ince, görünmez bir film vida halka konuları Coat. Aynı şekilde, kat konut conta. Herhangi bir görünür yağ silin.
- Kama konut anahtar ile hizalayarak hücre gövdesi içine, size doğru bakan pencere, bir pencere montaj sürgülü örnek hücre montaj başlayın. Merkezinde kaması konut anahtar ile aynı hizaya getirin ve yavaşça hücre içinde pencere montaj üstüne düşürdüm.
- Merkezinde hücre gövde içine itmek için her türlü aracı kullanmak. Bu deneyler sırasında sızıntısı sonucu CP kalıcı hasara neden olabilir. Pencere sizden uzağa merkezinde doğru bakacak şekilde çevirin ikinci pencere montaj, konut anahtar ile Kama merkezinde üstüne hizalayın ve aşağı doğru kaydırın. Üstünde bir konut conta yerleştirin, sonra bir vida halka "Out" sözcüğü görünür. Parmaklar ve bir hizalama aracı kullanarak, el vida halka sıkın.
CP konut varil kolayca slayt değilse, ilk hizalayın, daha sonra bunun üstüne ikinci bir pencere montaj yerleştirin. Pencere montaj hafifçe aşağı doğru basınç uygulayarak, aynı zamanda hücre gövde içine hem slayt. Bu şekilde, doğrudan CP basmaktan kaçının.
Şimdi toz, tüy bırakmayan ve parmak izi için hücre içine bakmak için iyi bir zaman olabilir. Ayrıca Newton'un CP ve pencereler arasında hava hala gösterir Yüzüklerin göreceksiniz. Bu tork uygulanarak sonra kaybolur. - Vida halka ve görünür "out" kelimesi ile tork stand hücre tork Halkalı örnek hücre içindeki tüm yol aşağı yerde. Tork stand sap üzerinde sabit bir basınç uygulayarak hücre tutun. Biri sürekli hareket, vida halka-lbs 120-140 arasında sıkın. Ayarlanabilir bir mikrometre tork anahtarı kullanarak, / kg 120-140 arasında ayarlayın ve ayarlanan tork belirten anahtarı "tıklama" ulaşıncaya kadar vida halka sıkın. Tork standı kolunu serbest bırakın ve pencereleri dokunmadan dikkatlice örnek hücre kaldırmak.
Örnek Hücresi Yükleme ve Sızdırmazlık
- Sedimantasyon hızı deneyleri için, rutin 200ul pipet kullanarak 12mm merkezinde her bir sektör haline 400ul hacmi yükleyin. Üst ve vida halka görünür "out" sözcüğü yükleme delikleri ile örnek hücre yerleştirin. SOL merkezinde sektörünün yükleme deliklerden içine pipet yarı yolda aşağıya doğru kaydırın ve yavaş yavaş referans çözüm 200ul dağıtmak. 400ul toplam bir kez tekrarlayın. Aynı pipet ve aynı tekniği kullanarak, dikkatli ve yavaş SAĞ merkezinde sektöründe örnek çözüm 400ul ile doldurun.
150-180 ul Birimleri sedimantasyon denge deneyleri için kullanılan ama aynı özen ve teknik takip edilmelidir.
Mümkün olan en yakın zamanda, referans ve örnek çözümler hacimleri maç için zorunludur. Yükleme kabarcıkları önlemek ve hem de çözümleri, mümkün olduğunca eşit olarak hacimleri tutarak tüm yardım için aynı pipet kullanarak, yavaş yavaş çözümler yükleme ve dağıtım, pipet pipet üzerine sıkıca takılması. - Seal, 2 yeni kırmızı konut fiş contalar merkezi parça ve alüminyum gövdesi arasında konumlandırılmış emin olmak için her yükleme deliğin içine rahatça koyarak hücre. Her bir konut fişi ile kaplayın. El küçük bir düz tornavida ile sıkın.
Rotor örnek Hücre Hizalama
- Rotor yüklemeden önce, karşı örnek hücre sızıntıları durumda ters pozisyonda örnek hücre daha fazla 0,5 g ÇAKMAK emin olun. Sıfır bakiye ile başlayın. İlk örnek hücre CB karşısında konumda olacak tartın. Dara örnek hücre kilo çıkarmak için denge, daha sonra, CB tartmak. Ekle veya ağırlığı dengelemek eki delikten çıkarmak. Ağırlıkları üst çıkıntı yok emin olun. Dengelemek son ağırlığı 0,5 g içinde ters örnek hücre daha hafif olduğunu sağlamak için Reweigh.
- 4-yer rotor kullanarak, beyaz ok görünür olduğunu, bu nedenle pozisyon 4 dengelemek yeri ve t işaretmerkezkaç kuvveti o yönde. Rotor içindeki tüm yol aşağı emin olun. Dengelemek yerine sıkıca kadar sadece beyaz ok karşısında dengelemek üstünde bulunan ayar vidası, hafifçe sıkın, ama yine de uyumlu hale getirilmesi mümkün. Gövde ile dengeli bir örnek hücre konumundaki rotor merkezi ve vida halka görünür "out" sözcüğü ile karşı karşıya fişler.
- Rotor altında bakıldığında, iç katip işareti (rotor merkezine yakın işareti), bir hizalama aracını kullanarak dengelemeye katip işareti ile aynı hizaya getirin. Yerinde uyumlu dengelemek kilit vidasını sıkın. Aynı şekilde, rotor pozisyon 2 içinde katip işareti ile örnek hücre katip işareti aynı hizaya getirin.
Daha fazla bilgi için bkz. https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Discussion
Rotor uygun hücre montajı, örnek ekleme ve hücre hizalama yüksek kaliteli EAA deneyler için kritik öneme sahiptir. Bu makromoleküler sedimantasyon profilleri elde edilen veriler çok ayrıntılı bir analiz gerektiren deneyler için, özellikle de doğrudur, örneğin, protein etkileşimleri eğitim ve eser agrega miktarda belirlenmesi. Genellikle deneysel kurulum kalite, doğruluk ve hassasiyet için EAA çalışmada elde edilen sonuçlar sınırlayıcı. 3 - ve pratik tasarımı EAA deneyler daha da yürütme hakkında ayrıntılı bilgi için, Referanslar 1 bakın. Atölyeler EAA deneylerin pratik kurulum, teori ve veri analizi kapsayan Ulusal Sağlık Enstitüleri bizim laboratuvarda yılda iki kez yapılıyor [4].
Acknowledgments
Biz araştırma desteği, NIH NIBIB İntramural Araştırma Programı tarafından kabul ediyorsunuz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Cell Housing kit | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Window gasket | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Window, sapphire | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Window, quartz | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Window holder | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Cell housing plug | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
