Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ Published: August 13, 2009 doi: 10.3791/1561

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Qingsheng Li¹, Pamela J. Skinner², Lijie Duan¹, Ashley T. Haase¹

¹Department of Microbiology, Medical School, University of Minnesota, ²Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

Summary

Yerinde tetramer boyama in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek bir tekniği görselleştirme, haritalama ve analiz, virüs bulaşmış hedefleri virüs spesifik CD8 + T hücreleri mekansal yakınlığı ve bu bağışıklık etkileyiciler ve hedefleri arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesi sağlar enfeksiyon sonuçlarını.

Abstract

Sayıları ve konumları virüs spesifik CD8 + T hücreleri enfekte hücrenin hedeflerine sayıları ve yerleri göreli açıklık kronik kalıcı enfeksiyonlar bu aralıktaki sonuçlarının belirlenmesinde kritik olduğu düşünülmektedir. Biz burada bir bağışıklık efektör (E) virüs-spesifik CD8 + virüse özgül CD8 + T hücreleri tespit etmek yerinde tetramer (IST) boyama birleştiren T hücreleri ve enfekte hedefleri (T) ve içinde in situ arasında mekansal ve kantitatif ilişkileri değerlendirmek için yöntemi tarif hibridizasyon (ISH), bağışıklık sistemi ve enfeksiyon arasındaki savaş gerçekleşir dokularda viral RNA + hücreleri algılamak için. T oranları: IST boyama ve ISH, kısaltılmış ISTH kombinasyonu immün efektör hücreleri ve hedefleri, ve E facile belirlenmesi yerleri görüntüleme ve haritalama sağlar. Bu parametreler sırayla sonra mekansal yakınlığı arasındaki ilişkileri belirlemek için kullanılır, ve erken enfeksiyon sonuçlarını tahmin immün yanıtın zamanlaması ve büyüklüğü olabilir

Protocol

Bu yöntem bildirilen araştırma Li ve ark, Bilim 323, 1726-1729 (2009) .

, In situ tetramer boyama ve in situ hibridizasyon (ISTH) prosedürleri birlikte

Antijen spesifik CD8 ISTH prosedürleri 4 adımda içine bölünmüş olması.:) 1 IST boyama + dokularda T hücreleri; 2) virüs-virüslü-RNA + hücreleri tespit için ISH; 3) IST-boyanan hücreler ve viral-RNA konfokal mikroskopik görüntüleme + hücreleri; 4) görüntü analizi, görüntü montajı inşaat ve haritalama tetramer + ve virüs RNA + hücreler de dahil olmak üzere.

1. IST boyama antijen-spesifik CD8 + T hücreleri, doku kesitlerinde.

1. Vibratome veya neşter kullanılarak 200 um kalınlığında kesitler taze dokular kesin.
2. Chill vibratome steril PBS-H ile banyo ve soğuk 0-2 ° C, oldukça sarp 27 ° vibratome bıçak açısını ayarlayın. Mümkün olduğunda, doku bozulması en aza indirmek için buz üzerinde soğutulmuş tutmak. Taze dokusu da soğutulmuş bir vibratome kullanarak bölümüne kolaydır.
3. Doku, cerrahi makas veya küçük yaklaşık 0.5 cm genişliğinde, 0.25 cm boyunda parçalara neşter ile kesiniz. Bir tartmak tekne veya küçük bir çanak koyun ve doku parçaları ile kaplayın ~ 40 ° C erimiş% 4 PBS agaroz erimeye düşük tamponlu. Doku çanak alt ile temas halinde olduğundan emin olun. Doku parçaları yüzen eğer aşağı doğru itin. Buz üzerinde katılaşmaya. Bu genellikle 3-5 dakika sürer.
4. Loctite yapıştırıcı ile kaplayın vibratome doku bloğu. Sonra forseps kullanarak bir neşter ve doku etrafında agaroz Kes, tutkalla kaplı vibratome blok dikkatlice kırılgan agaroz gömülü doku transferi. Doku blok sonra doku parçası hareket ettirmeyin. Buz üzerinde yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin.
5. Dağı doku vibratome blok ve ölü bir yavaş, ileri hız ve nispeten yüksek genlik kullanarak 200um kalınlığında kesitler doku kesmek. Hız ve genlik ayarları her vibratome ile değişir. Vibratome kullanılabilir, ya da doku kesit vibratome için uygun değildir, ince şeritler halinde bir neşter kullanılarak doku kesin.
6. Bölümleri içeren 1 ml soğutulmuş PBS-H 24-iyi doku kültürü plakası iyi ayarlanmış bir doku odasına bir fırça ile aktarın. Dört doku kesitlerinde kadar her doku odasına koyun. Bir lastik bant ile plaka deneysel örnek bilgileri ve güvenli kapak ile doku kültürü plaka kapağı Etiket.
7. Alternatif olarak, vibratome ile iyi kesmeyin dokular için, gut gibi, neşter veya ustura bıçağı ile mümkün şeritler gibi ince kesebilir. Neşter kesilmiş bölümler için başına sadece iyi bir bölümünde koyun.
8. Bitmiş kesme dokuların hemen sonra boyama geçin. Bölümleri her zaman sabit kadar bozulması en aza indirmek için soğutulmuş tutun. Bölümleri kurumasına izin vermeyin. Soğutulmuş steril PBS-H bölümleri tutun.
9. 0.5 mg / ml FITC konjuge tetramers doku bölümleri gece boyunca inkübe edin. Fare ya da çözümü engelleme 1:200 sulandırılmış bu inkübasyon ekstrasellüler epitoplar, örneğin anti-CD8 antikorlar, yönelik olmayan tavşan antikorları içerebilir. Bu ve sonraki tüm inkubasyon için ortalama 1 ml solüsyon kullanın ve bu ve 4 sonraki tüm inkubasyon ° C sallanan bir platform üzerinde plakaları ile gerçekleştirebilirsiniz. Sonraki adımda çözüm çapraz bulaşmayı önlemek için en az bir boş ayrılmış farklı deneysel örnekleri içeren bir doku odaları tutun.
10. Birincil inkübasyondan sonra, her biri için 20 dakika soğuk PBS-H iki katı (2X) bölümleri yıkayın. Soğutulmuş PBS-H içeren farklı bir 24-iyi doku kültürü plakası doku odalarına aktararak bunu yapın. Bir deneysel örnek diğerine içeriğini damla dikkatli olun, doku odaları taşırken. Benzer sonraki tüm inkubasyon ve yıkama için uygun bir çözüm içeren temiz bir tabak doku odalarına transfer. Bölümler doku odaları kenarlarına yapışmış alamadım emin olmak için prosedür sırasında doku odaları bölümleri izleyin.
11. Taze PBS ile Fix bölümleri, oda sıcaklığında 2 saat için% 4 paraformaldehid tamponlu. Soğuk PBS-H 2X her biri 5 dakika ile yıkayınız.
12. 1-3 gün boyunca bloke çözüm, 10.000: tavşan anti-FITC antikorlar, örneğin Biodesign1 inkübe edin. Co-etiketleme için de bu inkübasyon hücrelerarası epitoplar yönelik olmayan tavşan antikorları içerir. Bu seçenek için, gerekirse epitoplar ortaya çıkarmak ve nüfuz ve ikinci inkübasyon öncesinde hücrelerin engellemek.
13. Formaldehit fiksasyonu antijen alımı gerektiren intrasellüler epitoplar kullanarak antikorlar, mikrodalga fırın, 0.01m Üre kaynar 3 kez, her seferinde 10 saniye epitoplar maruz. Her ısıtma arasında 2 dakika bekleyin. Kaynar çözüm kuyular bölümleri zorlayabilir çok dikkatli olun. Bu durumda, bir boya fırçası kullanındoku odasının yanında kesitler itmek veya uygun doku odasının altına plaka kapağı. Antijen alımı antikorlar gerektirir yoksa bu adımı atlayabilirsiniz.
14. Önce ikinci inkübasyon, hücre içi epitoplar yönelik antikorları kullanarak, permeabolize ve PBS-H, bir saat süreyle% 0.3 triton X-100 ve% 2 normal keçi serumu içeren doku kesitlerinde hücreleri engellemek. Ardından% 0.3 triton X-100 ve% 2 normal keçi serumu içeren PBS-H kalan antikor inkubasyon gerçekleştirin.
15. Ikinci bir inkübasyondan sonra, birkaç saat 20 dakika PBS-H bölümleri yıkayın. Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez tekrarlayın. Uygun floresan etiketli antikorlar ile nihai bir inkübasyon gerçekleştirin. Örneğin, keçi anti-tavşan-Cy3 ve keçi anti-fare-Alexa 488 çözüm engelleme 1:1000 her seyreltilir. 1-3 gün süreyle inkübe edin. Bölümlerde ışık besler fluorophores gibi, bundan sonra bu inkübasyon sırasında plakalar kalay folyo sarma ve ışıktan korunmalıdır tutun.
16. PBS-H bölümlerde birkaç saat 20 dakika boyunca yıkayın. Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez tekrarlayın.
17. ISH post-fix bölümleri yere güvenli tetramers ve antikorlar için 1 saat için% 4 paraformaldehid post-fix ile birlikte IST için, daha sonra tekrar ve montaj bölümleri PBS-H ile durulayın.
18. Bir mikroskop lamı bölümler aktarmak için bir fırça kullanın. Kat gliserol / jelatin içeren 4mg/ml n-propil gallat veya bir lamel ile bir fluorofor koruyucu ve kapak içeren diğer montaj medya ile her bölüm. Mağaza -20 ° ışık korumalı slayt konteyner slaytlar. Doku kültürü plakaları yıkayın ve alkol ile kapaklar etiketleri kaldırmak. Plakalar yeniden mi.
19. Konfokal mikroskop ile boyanmış doku kesitlerinde analiz edin. Sonra ISH devam edebilirsiniz.

2. In situ hibridizasyon virüs bulaşmış-RNA + hücreler algılar.

Bu situ hibridizasyon protokol aşağıdaki gibi ^4,5 daha önce yayınlanmış protokoller güncellenmiştir:

1. Re-kesim yerinde tetramer boyanan kesitler kalın 5-8-mikron kalınlığında-sectionss.
   1. 200 mikron kalınlığında kesitler slayt bölümünü ayırmak için 70 ° C'de 5 dakika ısıtılır.
   2. Bu bölüm, daha sonra kuru buz üzerinde OCT yerleştirilmiştir.
   3. 8 mikron bölümleri kalınlığında kesitler Kriyostat ile kesilir ve Silanlanmış slaytlar yapıştırılır.
   4. Slaytlar in situ hibridizasyon -80 ° C daha sonraki bir kapalı kutu içinde saklanabilir.
2. In situ Hibridizasyon
   1. 3 dakika her biri için% 90 etanol ve DEPC arıtılmış su kaydırağı çeker doku bölümleri rehidrate.
   2. 98 ° C su banyosunda 15 dakika süreyle 10mM sitrat tamponu (pH 6.0) ısıtarak doku bölümleri Permeabilize.
   3. 20-30 dakika süreyle oda sıcaklığında Cool doku kesitlerinde.
   4. 3 dakika DEPC arıtılmış su iki kez yıkayın.
   5. 10 dakika için 0.1 M ÇAY (trietanolamin pH8.0)% 0.25 asetik anhidrit slaytlar çeker doku bölüm Acetylate.
   6. 5 dakika için 0,1 M ÇAY (pH8.0) içine slaytlar aktarın.
   7. Bölümlerine ³⁵ S etiketli virüs özgü antisens probu veya duyu (HIV-1 için negatif kontrol, SIV), veya ³⁵ G etiketli LCMV riboprobes (toplanmış hissi ve antisens) (HIV-1, SIV gibi). Melezleşme
   8. 42 gecede hibridizasyon 5 dakika sonra 2xSSC ile iki kez yıkayın bölümleri ° C
   9. STE bölümleri (0.5 M NaCl, 1mm EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7.5) 5 dakika boyunca yıkayın.
   10. 30 dakika 37 RNases Ste A ve T1 ° C bölümleri Digest
   11. 2x SSC bölümleri artı 5 dakika boyunca% 50 formamid yıkayın.
   12. Bölümleri 1x SSC 10 dakika yıkayın.
   13. Bölümlere 0,5 x SSC 15 dakika yıkayın.
   14. 70 bölüm, 80 ve% 100 etanol içeren 0.3 M amonyum asetat, her 5 dakika dehydrate.
   15. Kat bölümlerinde nükleer iz emülsiyon
   16. 1 saat boyunca karanlık bir odada kurulayın.
   17. 4 bölümleri Açığa ° C, 11 gün (SIV) ve 3 gün (LCMV).
   18. 3 dakika (Kodak, Kedi # 146 4593) D19 bölümleri geliştirmek, dH2O 30 saniye içinde, 4 dakika yıkayın (Kodak, Kedi # 146 4106) Rapid Fixer düzeltmek, dH2O 5 dakika x 3 kere yıkayın.
   19. % 70,% 80 ve mutlak etanol, her biri 5 dakika dehydrate.
   20. Floresan uyumlu Permount orta Mount slaytlar.

3. Konfokal mikroskop görüntüler elde.

1. Bio-Rad MRC 1000 Konfokal Mikroskop, ya da Epi2-Mavi Yansıma cihaz ile herhangi bir diğer konfokal mikroskop ile ISTH görüntüleri yakalayın.
2. (LCMV için), kırmızı tetramer florokrom, yeşil CD8 florokrom Epi2-522 DF32, ve gümüş tahıllar için Epi2-Mavi Yansıma (gelişmiş radioautographs ISH sinyal) 20x (SIV) veya 60x Epi1-605 kullanın.
3. Sırayla her alanın üç kanal 1 mikron aralıklarla Z seri görüntüler toplamak.
4. Her bölümün soldan görüntüler eldebir Excel dosyası, satır ve sütun göre sağa ve yukarıdan aşağıya doğru ve adı her görüntü.
5. Yeniden inşa montaj görüntü boşluklar önlemek için komşu görüntüleri ile bir ~% 20 üst üste her görüntüyü yakalayın.

4. Görüntü analizleri: montaj görüntü rekonstrüksiyonu, hücre centroid hesaplama ve Mekansal analiz.

1. Konfokal Yardımcısı (Sürüm 4.02). Ile her kanal için tek bir görüntü içine Proje Z seri görüntüler.
2. Photoshop 7.0 Eylem yordamı kullanarak, tek bir RGB görüntü otomatik olarak üç kanal yansıtılan görüntü birleştirme.
3. Photoshop 7.0 katmanları birleştirilmiş görüntüler dikiş montaj bir görüntü oluşturur.
4. Önlisans bireysel gümüş tahıl ve tetramer hücreleri ile leke ve X atamak, Y MetaMorph (sürüm 7.1.3) veya Photoshop (yazar), SIV RNA + ve tetramer + hücreler merkezleri (uzaysal) koordinatları
5. Her hücre için sayısal numaraları gibi Excel dosyaları içine ağırlık merkezi veri ihracat. E: T oranları Excel dosyaları bölümünde tetramer sayıların toplamı + ve viral RNA + hücreler belirlenir.

Mekansal, kırmızı tetramer + ve mavi SIV RNA arasındaki ilişkiler + hücrelerin kopyalama ve yapıştırma Photoshop belgeye Excel dosyaları kendi araziler yakalanır. Bunlar renk-seçerek ve kopyalama ve mavi RNA + hücreleri konumlarını bir yeni tabaka içine yapıştırarak, denk böylece ızgaraları hizalamak ve ölçek için bir katman donukluk, ve sonra ızgaraları hizalamak için kullanılan atarak katmanı, pozisyonlarını azaltarak sonra tetramer + ve viral RNA + hücreleri düzleştirilmiş görüntü ortaya çıkacak.

5. Ek Notlar

Bulaşıcı doku kesme Eğer:

Bir BSL2.5 laboratuarda çalışın. Tıraş bıçakları ile özel önlemler alın. Jilet bir forseps ile vibratome bıçak monte içine koyun. Bir forseps ile bıçak koyamazsınız, o zaman banyo için doku eklemek için önce koymak ve bıçak yerine geçmez. Bitmiş keserken bıçak, bir forseps ile çıkarın. Kaldırmadan önce, Sprey ile% 70 EtOH veya DMQ bıçak. Her zaman olduğu gibi, bir dikiş iğnesi konteyner bıçaklar atmayın. Dış eldiven değiştirme ya da doku veya tank içinde kirlenmiş PBS ile her temastan sonra dezenfektan durulayın. Bittiğinde, bulaşıcı bir malzeme ile çalışıyorsanız, tank içinde PBS DMQ dezenfektan ve kaldırılması için önce bir kaç dakika bekletin. Boşa dekontamine PBS atın. Sonra tuz ve dezenfektan kaldırmak için tankı su ile durulayın. DMQ ile temiz bir çalışma alanı ve gereçleri. Eşyaları su ile durulayın.

Biotinlenmiş MHC monomerlerin tetramers olun:

Gibi moleküller biotinlenmiş MHC sınıf Edinme HLA-A * 0201 / B ₂ m / ya Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV) Beckman Coulter veya alakasız MART peptid (ELAGIGILTV) peptitler ile üretilen peptid molekülleri. Biotinlenmiş HLA-A * 0301 / ya Gag (KIRLRPGGK) veya NIAID tetramer tesiste Nef (QVPLRPMTYK) ile üretilen B ₂ m / peptid molekülleri. Tetramers 6 alikotları etiketli FITC ekleyerek oluşturulur biotinlenmiş Mamu ExtraAvidin (Sigma) * 01 / B ₂ m / 8 saat boyunca son molar oranı 4.5:1 bir peptit monomerleri. Extravidin ekleyerek arkasındaki mantığı yavaş yavaş erken zaman noktalarında sırasında Extravidin bağlı dört biotin siteleri alır eklediğiniz garanti monomer bir overabundance olmasıdır. ExtrAvidin bağlı her 4 siteleri olmayacağını bir şans daha az monomer sol ve daha var, çünkü daha sonra tepki olarak, bu süreci daha az verimli. Bir kerede tüm ExtrAvidin eklediyseniz tepki, daha az verimli olacak ve daha Extravidin molekülleri sadece 2 ya da 3 monomerlerin bağlı olurdu.

Discussion

Virüs RNA, bu raporda virüsle enfekte olan hücreleri için bir belirteç olarak kullanılan olduğundan, hibridizasyon önce tüm reaktifler RNAase arındırılmış olmalıdır. In situ hibridizasyon prosedürü burada açıklanan floresan in situ tetramer boyama sinyal korumak için modifiye edilmiştir. In situ hibridizasyon tarafından tespit edilen virüs bulaşmış hücrelerin radioautographic sinyal tek-hücre çapı hakkında bir derinlikte olduğundan, in situ tetramer boyanması için kullanılan kalın bölümlerde 5-8 mikron kalınlığında bölüme recut olmak zorunda.

Burada anlatılan roman tekniği, in situ tetramers ve in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek Bu virüse özgül CD8 + T hücreleri ve virüs ile enfekte hedef hücreleri olan uzaysal ilişkisi eş zamanlı görüntüleme, haritalama ve analiz sağlayan. Bu yöntem, CD8 + T hücre tabanlı aşı değerlendirmek için uygulanan ve diğer non-virüs patojen ve konak etkileşimleri olabilir. Görüntü analiz yöntemi, burada açıklanan in situ etkileşen herhangi iki hücre popülasyonlarının mekansal ilişkileri incelemek için de adapte edilebilir, biz son zamanlarda insan dışı primat maymun bağışıklık eksikliği modeli HIV-1 cinsel yolla bulaşmasını eğitim centroid haritalama yöntemi kullanılır, örneğin rhesus, virüs enfeksiyonu ⁶ makakların

Materials

Solutions and Reagents:

PBS-H Phosphate buffered saline containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes RPMI tissue culture media containing heparin (100ug/ml or 18.7U/ml) to inhibit RNASes 4% low melt agarose in PBS PBS with 2% normal goat serum (or serum from species in which the fluorophore conjugated antibodies were made). PBS with 2% normal goat serum and 0.3% triton X-100 MHC class I tetramers conjugated to FITC Anti-FITC antibodies, e.g. BioDesign rabbit anti-FITC Fluorophore conjugated anti-rabbit IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling, e.g. goat-anti-rabbit-Cy3 Fluorophore conjugated anti-mouse IgG that has been highly cross adsorbed to other species IgG for use with multiple labeling Fresh PBS buffered 4% paraformaldehyde 0.01M Urea Glycerol/gelatin containing 4mg/ml n-propyl gallate

Special equipment

Vibratome Scalpel Razor blades Surgical scissors Loctite Quick Set Instant Adhesive (product # 46551) Forceps #2 camel hair paint brushes. Can trim with razor blade to desired thickness 24-well flat bottomed tissue culture plates e.g. Falcon catalog #353226 Tissue chambers Tin foil Cardboard slide folder e.g. Fisher catalog#12-587-10 Confocal Microscope

IST Reagents Quick Reference

PBS-H (phosphate buffered saline with heparin)

450 ml 1X PBS 50 ml 1X PBS + 10X heparin

1x PBS + 10X heparin

500 ml 1X PBS 500 mg heparin powder (found on dry chemical storage shelf)

PBS-H/ 2% NGS (normal goat serum)

49 ml PBS-H in Falcon tube 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 2% NGS/ 0.3% Triton X-100

49 ml PBS-H/ 0.3% Triton X-100 in Falcon tube 1 ml NGS (found in 1 ml aliquots in -20 freezer)

PBS-H/ 0.3% Triton X-100

500 ml PBS-H 1.5 ml Triton X-100 (this is a thick liquid found on dry chemical storage shelves)

4% LMP Agarose

2 g LMP agarose powder 50 ml PBS Shake until mixed, microwave until powder dissolves.

GG-NPG (glycerol gelatin with n-propyl galate

Place a bottle of glycerol gelatin in 50 degree water bath to melt Add 0.06 g of propyl galate (found on Terri's shelf), shake well Keep in water bath, shaking occasionally until dissolved. Aliquot into 1 ml tubes (brown tubes)

4% paraformaldehyde

4 g paraformaldehyde powder (found on dry chemical storage shelves) Put about 10 ml PBS-H in a graduated cylinder, add pf powder Add some water until volume reaches about 70 ml Add one dropper of NaOH. Stir until dissolved (usually about 20-30 minutes) Add HCl until pH reaches between 7-8. Bring volume to 100 ml with water.

Urea 0.01 M

0.3 g urea (found on dry chemical storage shelves) 500 ml water