Primer Uitbreiding Capture: Gerichte Sequence Retrieval uit zwaar vervuild DNA Bronnen

Summary

We presenteren een methode om gerichte oud DNA-sequentie ophalen, die we gebruikt om de complete mitochondriale genoom van vijf Neanderthalers individuen te reconstrueren. Vergelijking van deze sequenties met de huidige dag mensen suggereert dat Neanderthalers een langdurige lage effectieve populatiegrootte had.

Abstract

We presenteren een methode van gerichte DNA-sequentie opvragen uit DNA-bronnen die sterk afgebroken en verontreinigd met bacteriën DNA, zoals kenmerkend is voor oude botten. De methode vermindert monster vernietiging en sequencing eisen ten opzichte van PCR of shotgun sequencing aanpak direct. We gebruikten deze methode om de volledige mitochondriaal DNA (mtDNA), het genoom van de vijf Neanderthalers uit binnen hun geografische bereik te reconstrueren. Het mtDNA genetische diversiteit van de late Neanderthalers was ongeveer drie keer lager dan dat van de hedendaagse moderne mens. Samen met de analyses van mtDNA eiwit evolutie, suggereren deze gegevens dat de lange termijn effectieve populatiegrootte van de Neanderthalers was kleiner dan die van de moderne mens en de bestaande mensapen.

Protocol

Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Briggs et al.., Science 325 (5938). 318 tot 321 (2009) .

Reagentia vereist:

• AmpliTaq Gold DNA Polymerase
• 10x GeneAmp PCR Buffer II
• MgCl ₂ 25mm
• dNTP mix, 25 mM elk
• BSA, 10 mg ^ml-1 in het water
• Moleculaire biologie-grade water
• EB buffer (geleverd met MinElute PCR Purification kit), 10 mM Tris HCl, pH 8,5
• MinElute PCR Purification Kit
• M-270 streptavidine Dynabeads
• 2x Binding en Wash (BW) buffer (2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,2% Tween 20)
• 1x Binding en Wash (BW) buffer (2x BindWash buffer verdund 2X in het water)
• Hot Wash (HW) buffer (2,5 mm MgCl, 1X Taq Gold buffer, 0,1% Tween 20)

Voor informatie van de fabrikant met betrekking tot niet-standaard-reagentia en apparatuur zie verder tabel.

1) Bibliotheek versterking

1. Het DNA-template is hier een 454 bibliotheek die is bereid uit een laag copy number DNA-bron, zoals beschreven in (Rohland en Hofreiter, 2007a, 2007b) en (Maricic en Pääbo, 2009). Te versterken van de hele bibliotheek, de voorbereiding van de volgende PCR-mix:

   Reagens	ul per reactie
   Water	45
   10X Gene Amp PCR-buffer II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM elk)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR rvs primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA polymerase (5 U / pl)	1
   454 DNA-bibliotheek template	25
   Totaal	100

2. Gebruik de volgende PCR-programma in een Thermo cycler voor 14 cycli versterking
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C 30s
   3. 60 ° C (of de gewenste gloeien temp) 1 min
   4. 72 ° C 1 min.
   5. Ga naar 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. Zuiver de reactie op een Qiagen MinElute spin-kolom volgens instructies van de fabrikant. Elueren in 50 ul buffer EB.
4. Kwantificeren van de gezuiverde geamplificeerde product, alsook een hoeveelheid van de onversterkte bibliotheek met qPCR (Meyer et al., 2007).. Als het geamplificeerde product heeft meer dan 1 X 10 ¹² kopieën per ul, vermindering van de hoeveelheid template in de volgende Primer Uitbreiding stap om ervoor te zorgen dat niet meer dan 2 X 10 ¹² kopieën worden toegevoegd aan de Primer Extension reactie.

2) Uitbreiding Primer

1. Bereid een master mix voor het vereiste aantal reacties.

   Reagens	ul per reactie
   Water	45
   10X Gene Amp PCR-buffer II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM elk)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR rvs primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA polymerase (5 U / pl)	1
   454 DNA-bibliotheek template	25
   Totaal	100

2. Voert u de volgende programma in een Thermocycler voor de interne primer extensie reactie:
   1. 95 ° C 12min
   2. 60 ° C (of uw PEC primer annealing temp indien verschillend) 1 min
   3. 72 ° C 5 min
   4. 72 ° C voor altijd!
      
      Kritische stap Houd reactie na verlenging bij 72 ° C. Dan direct pipet 150ul PBI of PB buffer voor QIAGEN MinElute zuivering in de buizen voordat u van de hitte te blokkeren. Dit is belangrijk om niet-specifieke primer annealing te vermijden en als het mengsel afkoelt vast te leggen.
3. Zuiver de reactie op een Qiagen MinElute spin-kolom, volgens de instructies van de fabrikant. Elueren in 50 ul EB.

3) Uitbreiding Product Capture

1. Resuspendeer voorraad oplossing van M-270 kralen door vortexen. Haal 25 ul kraal schorsing per monster. Twee keer was de korrels met 500ul 2x BW buffer en resuspendeer in 25 ul 2xBW buffer per monster.
2. Voeg 25 il eluaat van stap 2.3 tot 25 ul hiel schorsing vanaf stap 3.1. Meng vervolgens draaien voor een5 minuten bij kamertemperatuur.
   
   Aanbevolen: houd resterende 5 ul van het eluaat van stap 2.3 voor qPCR kwantificering.
   
   
3. Breng het hele mengsel in een verse buis 1,5 ml (dit helpt bij het verminderen overdracht van niet-doelsoorten bibliotheek fragmenten). Pellet het supernatant met behulp van de magnetische deeltjes collector (MPC) en gooi het supernatant.
4. Was 5 keer met 500 ul 1xBW buffer (vele wasbeurten te helpen verwijderen zoveel mogelijk achtergrondinformatie). Na de laatste wasstap, kort draaien en verwijder de laatste sporen van supernatant.
5. Voeg 500μl 1x Hot Wash (HW) buffer. Schud gedurende 2 minuten bij 65 ° C (of 5C boven de PEC primer Tm) op een thermisch blok. Snel Verwijder de bovenstaande vloeistof na dit, het minimaliseren van afkoeling. (Deze stap is het verwijderen van achtergrond fragmenten nog steeds geassocieerd met de PEC primers maar niet echt uitgebreid tijdens de extensie stap). Verwijder de laatste sporen van supernatant.
6. Resuspendeer de kraal pellet in 30 ul EB buffer. Breng het hele mengsel in een verse buis 1,5 ml (dit helpt bij het verminderen overdracht van niet-doelsoorten bibliotheek fragmenten). Incubeer bij 95 ° C gedurende 3 minuten in een thermische cycler voor elutie. Plaats in de MPC en verwijder het supernatant, zorg ervoor dat de kralen achter te laten.

4) Capture Product Versterking

1. Bereid een PCR Master Mix voor het vereiste aantal monsters.

   Reagens	ul per reactie
   Water	45
   10X Gene Amp PCR-buffer II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mM elk)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR rvs primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA polymerase (5 U / pl)	1
   Eluaat capture product	25
   Totaal	100

2. Gebruik de volgende PCR-programma in een Thermo cycler voor 14 cycli versterking:
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C 30s
   3. 60 ° C (of de gewenste gloeien temp) 1 min
   4. 72 ° C 1 min.
   5. Ga naar 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. Zuiver de reactie op een Qiagen MinElute silica spin-kolom volgens instructies van de fabrikant. Elueren in 50 ul EB buffer. Het product kan nu gebruikt worden voor een tweede ronde van vast te leggen, te beginnen bij stap 2.1 worden opgenomen of direct in de 454 emulsie PCR-protocol, voor het rangschikken.

Representatieve resultaten:

Het wordt sterk aanbevolen bij het starten met de PEC-protocol om eerst een capture reactie waarbij een kleine hoeveelheid van een 'positieve controle doelsequentie' (bijvoorbeeld een ~ 100 bp PCR-product - 1 picogram is gemakkelijk genoeg) uit te voeren wordt vermengd met de normale aanbevolen hoeveelheid van 454 versterkte bibliotheek template (zie stap 2.1), en vastleggen wordt uitgevoerd met een enkele PEC primer ontworpen om de positieve controle product vast te leggen. Als deze controle reactie wordt uitgevoerd, qPCR met zowel positieve controle-specifieke en 454 adapter-specifieke primer paren kan worden gebruikt om de hoeveelheid 'control target' versus achtergrond in het gezuiverde primer extensie reactie (1.3), primer extensie product (2,3 kwantificeren ) en geëlueerd bead capture product (3.6). Op deze manier kan zowel de effectiviteit van de achtergrond verwijderen ("specificiteit") en de efficiëntie van de beoogde herstel ("gevoeligheid") in uw experimentele condities direct worden gemeten.

Een succesvolle PEC protocol heeft doorgaans de volgende eigenschappen -

Gevoeligheid (gemeten door mate van controle doelgroep behouden door het protocol):
Totaal bedrag van controle target in eluaat kraal capture product (3.6) = ~ 1-20% van het totale bedrag in gezuiverde primer extensie reactie (2.3).

Achtergrond (gemeten door 454 emPCR primerpaar):
Totaal bedrag van de achtergrond in geëlueerd kraal capture product (3.6) <0,01% van het totale bedrag in gezuiverde primer extensie reactie (2.3).

Als er minder dan 1% van de doelgroep die nog in het eindproduct, kan de primer extensie stap ongelijk zijn gesteld en moeten worden onderzocht.

Als er is veel meer dan 0,01% van de achtergrond achterblijft in de uiteindelijke producten, kan de wasstappen onjuist zijn uitgevoerd en moeten worden onderzocht.

Discussion

De PEC methode is eenvoudig, snel, gevoelig en specifiek. Daarom hebben we de auteurs van plan meerdere toepassingen buiten de oude DNA, zoals de vangst van kleine RNA-fragmenten uit een RNA-bibliotheek, de ondervraging van de structurele variatie in een verzamelmonster of vangen van 16S (of andere loci) diversiteit vanuit een metagenomic monster. Een punt om te vermelden is dat de gevoeligheid van de vast te leggen lager wordt naarmate het aantal PEC primers in een multiplex capture reactie toeneemt. PEC is daarom niet bij uitstek geschikt voor het vastleggen van zeer grote (bijvoorbeeld een megabase of meer) vast te leggen regio's, maar is uitermate geschikt voor het vastleggen van kleine doelgroep regio's of zelfs SNP posities van vele individuen in een snelle manier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmpliTaq Gold polymerase with GeneAmp PCR buffer II and MgCl2	Applied Biosystems	N8080241
QIAGEN MinElute PCR purification kit	Qiagen	28004
M-270 streptavidin beads	Invitrogen	653.05
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
DynaMag-2 magnetic particle separator	Invitrogen	120.02D