Summary
Polimerlerin doku mühendisliği ve hücre kültürü için elektrospinning süreci, bu makalede ele alınmaktadır. Özellikle multi-polimer elektrospinning photopatterning ve ek işleme yetenekleri ile photoreactive macromers elektrospinning açıklanmıştır.
Abstract
Doku mühendisliği alanında geliştikçe, daha karmaşık organ ve dokuların gereksinimlerini (örneğin, mekanik ve damarlanma) ele almak üzere daha uygun malzeme ve işleme teknikleri üretmek için çok büyük bir bir talep var. Elektrospinning yerli ekstraselüler matriks mimarisi ve büyüklük ölçeği taklit fibröz iskeleleri oluşturmak için popüler bir tekniktir. Lifler, kök hücre farklılaşma (bkz. Mauck tarafından geniş yorumlar da dahil olmak üzere, hücresel davranışı doğrudan kullanılabilir beri bu fibröz iskeleleri de hücre kültürü substrat olarak yararlı
Protocol
A. Tek Polimer elektrospinning
- Elektrospinning çözüm hazırlarken önce, birkaç gün boyunca 37 ° C eriterek photoinitiator 0.5 ağırlıkça% çözüm Irgacure 2959 (I2959), deiyonize su. Bu adım, bir photoreactive polimer kullanılıyor ise gerekli değildir.
- 2 ağırlıkça% Meha, 3 ağırlıkça% nihai bir konsantrasyon ile bir çözüm hazırlamak için methacrylated hyaluronik asit (Meha, Burdick ve ark. Sentezi için), poli (etilen oksit) (PEO, 900 kDa) ve deiyonize su I2959 birleştirin PEO, ve 0.05 ağırlıkça% I2959. Netleşene kadar çözüm karıştırmak için bir girdap kullanın. Polimer tipi ve konsantrasyonu, kullanılan solvent gibi, bu aşamada istenilen iskele özellikleri bağlı olarak değiştirilebilir.
- Çözümün bir şırınga içine aktarın ve sonuna kadar 18 gauge, 6 inç uzunluğunda, künt uçlu iğne takın.
- 1.2 ml / saat hızında çıkarmak için bir şırınga pompası. Cihazın içine şırınga ve iğne takın.
- Yüksek gerilim güç kaynağı topraklı kurşun toplama cihazı takın. Rastgele dağıtılan lifler düz bir metal plaka kullanan toplamak veya hizalanmış lifleri toplamak için ~ 10 m / s hızla dönen bir mandrel kullanmak için. Için pozitif yüklü kurşun iğne takın. Elektrospinning aparat şematik Şekil 1 Bkz.
- Ikisi arasında 15 cm mesafe olduğu gibi iğne veya toplama cihazı, ayarlayın.
- Şırınga pompası akışını başlatın. Sıvı iğne ucu görüntülendi olduğunda, güç kaynağı açın ve 22 kV gerilim.
- Koleksiyonda (ince film için birkaç dakika, 24 saate kadar kalın mat) tamamlandıktan sonra, iskele toplama cihazı çıkarın ve solvent tümüyle kaldırılmasını sağlamak için gece boyunca vakum altında saklamak.
- Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak lif morfolojisi gözünüzde canlandırın, bir temsilci iskele aynı hizaya ve non-hizalanmış yapıları Şekil 1'de gösterilmiştir.
Not: örnek akış hızı, toplama cihazı olan mesafe ve gerilim polimer ve solvent kombinasyonu bağımlı ve genellikle iskele morfolojisi SEM ile gözlemleyerek, her bir sistem için optimize edilmiş olmalıdır.
B. Photocrosslinking ve Photopatterning
- Iskele mat 5mm x 5mm örnekleri kesin.
- Her iskele, folyo kaplı bir cam slayt yerleştirme, iskele doğrudan photomask yerleştirerek, temiz bir cam slayt kaplama ve bağlayıcı klipler ile her iki ucunda kırpma crosslinking için hazırlayın. Not: dört örnekleri bir defada yapılabilir ve bir desen istenilen değilse bir desen olmayan bir şeffaflık crosslinking için kullanılabilir.
- Temizle iskele azot odasında kurdu. Crosslinking inhibe edebilir oksijen, inşa serbest tutmak için önemlidir.
- ~ 10 mW / cm 2, 5 dakika boyunca collimating adaptör ile 365 nm ışığı altında azot odasında Yeri iskele kurulum . Şekil 2'de şematik bakınız.
- 12 plaka her iskele ve yer çıkarın.
- Her iyi parafilm plaka 37 ° C'de 24 saat süreyle su yeri ve buharlaşmasını önlemek için 2 mL deiyonize su ekleyin. Üç kez su değiştirin.
- Işık mikroskobu altında gözenek oluşumu (Şekil 2 örneğe bakın) gözünüzde canlandırın. Iskeleleri artık kullanıma hazır.
Not: Photocrosslinking polimerlerin birçok türleri için, ancak photopatterning sadece photoreactive polimerler ile gerekli değildir.
Floresan Fiber Görselleştirme C. Çift Polimer elektrospinning
- % 90 etanol içinde PEO (200 kDa) 5 ağırlıkça% çözelti hazırlayın. 50 ° C'de en az 2 saat önce elektrospinning 700 rpm'de karıştırın.
- PEO çözüm bir şırıngaya aktarın ve elektrospinning çözüm son konsantrasyon için 10 mg / ml konsantrasyon DAPI ekleyin. Şırınga ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarın.
- Elektrospinning çözüm 25 mcM son bir konsantrasyon için methacryloxyethyl thiocarbamoyl rodamin B (MeRho 683,24 g / mol) eklemek de dışında, adım A2 açıklanan aynı çözüm hazırlayın. Şırınga ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarın.
- Mandrel yüzeyinde methacrylated cam lamelleri (Khademhosseini ve ark.) Güvence altına almak için dikkatlice seloteyip kullanın. Not: elyaf methacrylated cam lamelleri için gergin olacak.
- Döner kilit ekleri ile bir şırınga silikon boru 5 mm uzunluğunda bir parça bir ucunu takın ve diğer ucunu bir iğne takın. Şırınga pompası içine şırınga takın ve vantilatör delikten iğne koymak. Mandrel ters sitesinde diğer şırınga ve vantilatör tekrarlayın. Fanners l çevirmekmandrel ength ve çıkan iskele, iki polimerlerin eşit dağılımını sağlamak için kullanılır. Şekil 3'te şematik bakınız.
- Bölüm A uygun Tablo 1'e göre açıklanan parametrelerini ayarlayın. Iğne uçları mandrel merkezli emin olun.
Tablo 1. Çift Polimer elektrospinning ParametrelerŞırınga Vantilatör İğne İpucu (cm) İğne İpucu Mandrel (cm) için Akış Hızı (ml / saat) Uygulamalı Gerilimi (kV) Meha 6 15 1,2 +22 PEO 6 10 1,2 +15 - Her şeyin düzgün hizalanmış sonra, ışıkları kapatmak ve mili ve şırınga pompalar açmak. Şırıngalar alüminyum folyo çıkarın. Sıvı, hem de iğnelerin uçları görünür olduğunda, aynı anda fanners güç kaynakları ve fiş açmak.
- Toplama işlemi tamamlandığında, güç kaynakları ve mandrel fanners kapatın ve fişten çekin. Bir jilet kullanarak lamelleri ve bant dikkatli bir şekilde kaldırın.
- Rodamin ve DAPI filtreleri ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak lifleri gözünüzde canlandırın. Şekil 3 örneğe bakın. Not: süresi (<3 dakika) kısa bir süre için electrospun, ancak, bu sürecin özellikle cam lamelleri kullanılmadan, kalın yapıları oluşturmak için bir zaman sınırsız miktarda uzatılabilir zaman görüntülemek için Floresan lifleri en net .
Yapı iskeleleri D. Yayımlama Hücreler
- Electrospun polimer ile her bir birey haline uygun boyutta bir plaka takılı lamel yerleştirin. Not: lifleri ile hücresel etkileşimleri methacrylated cam lamelleri üzerine elektrospinning tarafından kolayca görülebilir. Ayrıca, MeRho lif görünüm için tekrar kullanılmamalıdır.
- Solvent tamamen kaldırılması ve olası yan ürünleri salabilen sağlanması için PBS içinde iskeleler gece inkübe edin.
- Kuyulardan PBS çıkarın.
- Iskeleleri sterilize etmek için, 30 dakika boyunca bir laminer akış kaputu bir antiseptik lamba altında yerleştirin. Tam bir iskele numaralı seribaşı ise, bir antiseptik lamba altında bir 30 dakika içinde iskele ve yer çevirin.
- Standart hücre kültürü gerçekleştirmek ve (örneğin, 6.000 hücreleri cm -2) istenilen hücre yoğunluğu konsantre bir hücre süspansiyonu hazırlamak. Örneğin, bir 22 mm X 22 mm lamel için 100 ml hücre süspansiyonu kullanın. 1 saat için kuvöz koyun.
- Her kuyuya uygun miktarda hücre kültür ortamı ekleyin. Iskeleleri inkübatör içine yerleştirin.
- Leke piyasada mevcut Live / Dead kitini kullanarak hücrelerin. Not: DAPI (hücre çekirdekleri) ve floresan etiketli Phalloidin (aktin stres lifleri) gibi hücre boyama diğer türdeki hücrelerin görselleştirmek için uygulanabilir.
- TRITC ve FITC filtreleri ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak hücre ve lifleri gözünüzde canlandırın. Şekil 4'te örneğe bakın.
Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1. aygıt kurulum olmayan hizalanmış iskele oluşumu (üstte) ve hizalı iskele formasyonu (alt) gösteren şematik. Her tip iskele örneği taramalı elektron mikroskobu görüntüleri gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 5μm. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
Şekil 2 desenlendirme yönteminin şematik. Desenler photocrosslinking sırasında ışık kaynağı ve iskele arasında photomask yerleştirerek ve sonra uzakta girmemiş polimer yıkama oluşur. Gözenek oluşumu ve liyofilizasyon sonra iskeleleri Photomask ve SEM görüntüsü. Ölçeği bar = 100 mikron. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3 multi-polimer elektrospinning kurulum ve gerekli işleme parametreleri şematik yanı sıra, iki adet elyaf nüfus (örneğin: kırmızı Meha ve mavi PEO) karışımı bir temsilcisi floresan görüntü, bir multi-polimer iskele oluşturacak şekilde aynı anda electrospun . Ölçeği bar = 100 mikron. Lütfen daha büyük bir versio görmek için buraya tıklayınŞekil 3 n.
Şekil 4. Bir örnek insan mezenkimal kök hücreleri ve electrospun lifleri ile olan etkileşimleri Dead / Canlı boyama görüntü. Ölçeği bar = 100 mikron. Lütfen Şekil 4 büyük halini görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektrospinning polimerler fibröz iskeleleri hazırlamak için kullanılmıştır. Photocrosslinkable ışığa maruz kalma çapraz bağlanma için gerekli olan bir örnek olarak kullanılan hyaluronik asit dayalı iskele. Meha olarak reaktif macromers, kullanımı ile, daha önce gelişmiş hücresel dağılım göstermiştir kanallar, makro ve mikro gözenekli iskeleleri formu photocrosslinking sırasında bir maske kullanımı ile iskeleler dahil edilmiştir. Ayrıca, aynı anda iki farklı polimerler bizim özel aparat kullanarak electrospun edildi. Iki farklı lif popülasyonlarının varlığını, daha sonra bir floresan mikroskop kullanılarak izlenebilir her elektrospinning çözüm floresan boya ilavesi ile doğrulandı. Multi-polimer iskeleler, hücresel dağılımı, yanı sıra tek bir polimer electrospun iskeleleri göre belirli bir uygulama için daha iyi bir ayar mekaniği ve bir iskele bozulması geliştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, sterilizasyon ve iskeleler hücre tohumlama kanıtlanmıştır. Bu tekniklerin çoğu çok yönlü ve hücre kültürü ve doku mühendisliği uygulamaları için farklı iskeleleri imal etmek için bir dizi farklı polimerler için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, JLI ve National Institutes Heath hibe R01AR056624 bir Amerikan Kalp Derneği predoctoral Bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Reagent | Invitrogen | D1306 | |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| PEO 200 kDa | Polysciences, Inc. | 17503 | ||
| PEO 900 kDa | Reagent | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Live/Dead Stain Kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells) |
| Syringe Pump | Equipment | KD Scientific | KDS100 | Two are needed for dual polymer spinning |
| Power Source | Equipment | Gamma High Voltage | ES30P-5W | Two are needed for dual polymer spinning |
| Motor | Equipment | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Equipment | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| Silicone Tubing | Equipment | McMaster-Carr | 51135K151 | |
| Luer Lock Female Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K293 | |
| Luer Lock Male Adapter | Equipment | McMaster-Carr | 51525K143 | |
| Needles | Equipment | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Equipment | Corning | 2875-22 |
References
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).
- Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment. J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).
- Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration. Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).
- Sill, T. J., Von Recum, H. avon Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity. , Forthcoming (2009).
