組織工学のための3Dハイドロゲルの細胞のカプセル化

Summary

我々は、合成ハイドロゲル内の細胞の3次元（3D）カプセル化するためのプロトコルを提示する。カプセル化手順は、次の2つの一般的に使用される架橋の方法（マイケル型の加算と光 - 開始フリーラジカル機構）だけでなく、カプセル化された細胞の挙動を評価するためのテクニックの数のために概説されています。

Abstract

ヒドロゲル内の細胞の3次元カプセル化は、細胞を培養するためと組織工学のための構造の開発に向けてますます重要と一般的な手法を表します。この環境は良く、標準の組織培養に比べて、細胞がin vivoで観察するのか組織のようなプロパティや3D環境のために模倣している。合成高分子ハイドロゲルは、安定しているようにしたり、新しい組織がカプセル化された細胞によって堆積されるとして、加水分解やタンパク質分解を介して分解するように設計することができる水膨潤ネットワークです。ポリマーの多種多様なポリ（エチレングリコール）とヒアルロン酸のようなこれらのアプリケーション用に検討されている。最も一般的に、ポリマーは、メタクリレートまたは様々なメカニズムを介して架橋を行うことができるアクリレート等の反応性基で官能化されています。カプセル化された幹細胞（。バーディックら ）の分化を含む実行可能性と直接細胞の表現型を、改善するために-生化学的手がかりの物理的またはペンダント共有結合の取り込みによるなど、 -過去十年間で、多くの進歩は、これらの微小環境工学で行われている。

細胞の3次元カプセル化するための次のメソッドは、cytocompatibilityを最大化し、ハイドロゲルの処理ステップの数を最小限に抑えるために私たちや他の研究室に最適化されています。次のプロトコル（手順の図は、図1を参照）で、それは架橋を受けることができる官能化ポリマーが手にすでに存在することを前提としています。ティッシュエンジニアリングの分野に適用される高分子化学の優れたレビューは他の場所で見つけることができる（バーディックら。）及びこれらのメソッドは、ポリマーの種類の範囲と互換性があります。さらに、ここに焦点を当てたマイケル型加算（Lutolf らを参照してください。）及び光開始フリーラジカル（エリセーエフらを参照してください。）メカニズムが報告された架橋技術のごく一部を構成する。反応性基の部分が最初に加えて架橋によって消費されるとラジカル機構に先行しているの混合モードの架橋は、カプセル化された細胞（Khetan ら 、サリナスら ）の表現型を誘導するための別の一般的に使用されると強力なパラダイムです。

Protocol

A.材料の調製と滅菌

1. 事前の準備を封止材料に混合し、37数日間℃でインキュベートすることによって、、（PBS）リン酸緩衝生理食塩水の光開始剤イルガキュア2959（I2959）の0.5重量％の溶液を調製解決策は、シリンジ滅菌のためにフィルタリングし、長期的な使用のために室温で保存することができます。
2. 合成しようとするゲルの所望の組成に基づいて、（Microsoft Excelなどのスプレッドシートプログラムを使用して）必要なポリマーと架橋剤の重量を計算する。ポリマーの特定の重量はヒドロゲル中の所望の濃度を達成するために定義された総量に溶解する必要があるため、合計ゲルの体積の架橋剤と高分子溶液の部分は、スプレッドシートを使用して決定する必要があります。任意のペンダント部分（例えば、オリゴペプチドを含有する接着剤RGDまたはYGSRが）前の架橋に組み込まれる場合、同様の計算がなされるべきである。
3. エッペンドルフチュー​​ブにポリマーと架橋剤と場所の必要量を秤量する。得られたポリマーの実際の重量のためにそれに応じて計算のスプレッドシートを調整します。 （ 注 ：ボリュームは得られたポリマーと架橋剤の実際の質量を補償するために変更することができます）。
4. 個別包装滅菌1 mLの使い捨て注射器の上部をカットオフするためにカミソリの刃を使用してゲルの金型を準備します。フラットカットが光パターン形成のゲルに使用する金型のために作られていることを確認します。
5. シリンジ型、エッペンドルフチュー​​ブ（キャップ​​を開いた状態で）、および殺菌用光源（通常は生物学的安全キャビネットに組み込まれている）の下にその他の必要な材料を置き、30分間滅菌する。

B.セルの調製

1. 滅菌に続いて、適切な滅菌緩衝ボリュームを追加する（表計算ごとに、バッファの選択は、異なるPBSおよびトリエタノールアミンなどの弱塩基のバッファは、通常、フリーラジカルとマイケル型架橋、それぞれに使用されることができますが）ポリマーエッペンドルフとする（オプション）ペンダントの部分に含まれる（例えば、接着性ペプチド）と溶解するために渦（無菌フードラップの外側にパラフィルムでエッペンドルフをボルテックスする場合）。
2. ポリマー溶液にペンダント部分のソリューションの適切な量を追加し、パラフィルムでシールを包む。 37簡潔にボルテックスし、インキュベート° Cが細胞の準備中に（可能であれば、回転式攪拌プレートの上）に反応する。ペプチドが最終的なヒドロゲルのペンダント基として含まれているようにこれは、アクリル酸またはメタクリル酸のペプチドのチオールの反応を（システイン基を介して）が含まれます。
3. トリプシン処理および細胞とゲルのセットごとに適切な数を含んでいる部分に分離して数える。たとえば、10万細胞/個々のコニカルチューブに加え、独立した150万細胞の密度で、3つの50μLのゲルのセットのため。それはこれ以上4よりゲルはゲル化のタイミング（：ゲルの複数のセットを合成する場合、すべてのセットに対して、ポリマー溶液の適切な量を含む単一のエッペンドルフは、調製することができる注）により、個々のセットで準備することをお勧めします。
4. 細胞を遠心分離します。
5. 細胞は、スピンダウンしている間
   1. 光は、フリーラジカル架橋を開始 ：総ゲルセットボリューム（0.05重量％の最終的な開始剤濃度用）の10％に相当するポリマー溶液に0.5重量％I2959ソリューションを追加します。
   2. マイケル型（加算）架橋 ：適切な濃度溶液を達成するために架橋剤にバッファを追加する。
   3. シーケンシャル架橋のために ：これらのゲルは、架橋の両方のタイプを組み込むと、前の手順の両方が必要です。

C.ハイドロゲル形成

1. 遠心分離した細胞の部分から上清を吸引除去する。細胞ペレットを中断することなく、できるだけ多くのメディアを削除するには、最初の吸引および再吸引後に安定する液体のを待ちます。
2. 細胞が均等に分散されるまで、ポリマー溶液で細胞ペレットを再懸濁します。溶液をゆっくりピペッティングして気泡の形成を最小限にし、ダウン（およそ10サイクルは、細胞を分散するために十分なはずです）。
3. 架橋ゲル
   1. シリンジの先端の金型に分注して、適切な量を： 光は、フリーラジカル架橋を開始した 。ラジカル架橋のために紫外線にシリンジを公開する（例えば、波長365nm〜10分露光、4 mW/cm2紫外光は、アクリレート官能化ポリマーが一般的です）。このステップは、UV光を露光する前にセトリングセルを最小限に抑えるために迅速に実行する必要があります。
   2. マイケル型（加算）架橋 ：広いオリフィスのピペットチップを使用して、ポリマー/セルソリューションへの架橋剤溶液を適切な量を追加し、希望する個々のゲルのボリュームにピペットを設定し、上下への解決策をピペッティングホモジナイズし、シリンジの先端の金型に分注し。このステップは、細胞の均一な分布を確保するために迅速に実行する必要があります。架橋用の培養フードの10-30分は（個々のシステムに応じて）インキュベーション許可する。
   3. シーケンシャル架橋 ：これは、その後、ミカエル型加算の最初の反応と第二架橋のために光照射を伴う。唯一の理論的架橋の割合は、最初の架橋時に反応させることが必要として無菌マスクが前に滅菌ピンセットを用いて光照射にゲルの表面に直接適用する必要があります。それはゲル（図2の根本的に架橋した地域で優先的に組み込むことになるための官能化染料（例えば、20nmのゲル中の最終濃度でメタクリルローダミン（MeRhoが））また、パターニングを視覚化するために最初の溶液に添加されることがあります）。

D.細胞培養と分析

1. 以下の架橋、インキュベーションおよび分析のためにメディアを含む組織培養プレートのウェルに突入するのゲル（次の手順を参照）。
2. 蛍光デッド/ライブ染色キットを（図3と図4）を使用してと生存率、細胞が形態の光学顕微鏡（一般的に、合成されたハイドロゲルは、透明な図3）を使用するための視覚化できます。細胞アクチン（例えば、ローダミンまたはフルオレセインファロイジン標識された）と核（例えば、4' - 6 -ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI））の染色は、以下の手順で標準の固定と透過処理手順（図4）を使用して実行することができます。
   1. PBSで5分間3X構造をすすぐ。
   2. 室温で30分間1 mLの4％ホルムアルデヒド中でのインキュベーションにより、ゲルを固定してください。
   3. 3％（w / v）のBSAと0.5％（w / v）のPBSでTweenを含むブロッキング溶液で3倍の構造をすすいでください。
   4. 0.25％（w / v）の20分間ブロッキング溶液のトリトンXで膜を透過処理。
   5. ブロッキング溶液で3倍の構造をすすいでください。
   6. 室温で2時間ブロッキング溶液で0.66μg/ mLのFITCまたはローダミンファロイジンでF -アクチンのために染色。
   7. ブロッキング溶液で3倍すすいでください。
   8. 20分間、0.4μL/ PBS中DAPIを使用して細胞核を染色する。
   9. PBSで3倍リンス。
   10. 落射蛍光または共焦点顕微鏡を用いて細胞を視覚化する。
3. ゲル内の細胞の増殖は、一般的に市販のアッセイ（例えば、全DNAまたは生化学的なコンテンツ）を用いて評価される。 PicoGreenは、二本鎖DNAを（歌手ら。）定量化するための染色、一般的に使用されると感受性蛍光核酸である。セルもカウントし、ステップ2で説明されている可視化メソッドを使用して初期の管理番号に正規化することができる。
4. 組織学的切片と染色は、細胞を可視化し、マトリックスを形成するために使用することができます。 3Dハイドロゲルの脱水とセクショニングの以下のプロトコルは、スライドガラス上に断面スライスを得るために使用されることがあります。
   1. 固定と脱水
      1. PBSで3倍試料をすすぐ。
      2. 4％パラホルムアルデヒドで30分 - 5を修正しました。
      3. PBSで3倍試料をすすぐ。
      4. 25℃EtOH中でサンプルをインキュベート° C以下のエタノール（v / v）の水の濃度（順番に）のそれぞれで1時間：50％、70％、95％、95％、100％（この時点で、サンプル25℃で一晩保存することができます° C）。
   2. クリアと浸透
      1. 25 1時間に100％Citrisolv 65℃で一時間に続いてC、℃に転送する
      2. サンプルの断面が露出するようにペトリ皿にカミソリの刃で半分にサンプルをカット。
      3. Citrisolv / 65で1時間、マイクロカットパラフィン℃の1:1混合物への転送
      4. 65℃1時間の100％マイクロカットパラフィン℃に転送する
      5. 65℃一晩100パーセントマイクロカットパラフィンに転送℃に
      6. 65で1〜2時間の100％マイクロカットパラフィン℃に移し
   3. 埋め込 ​​み
      1. ピールアウェイ100％のパラフィンと金型の位置の標本。
      2. 金型の床のワックスを少量を置き、断面が下に向くようにサンプルの半分ずつを挿入します。
      3. 上部フィルターの部分を適用する
         1. 水没トップピースをするために追加のワックスを追加し、〜10分間硬化することができます。
      4. ° Cの冷蔵庫では硬化に試料を一晩できるように4にインサートを移す。
      5. 試料は、セクションがあります一般的に市販のミクロトームを使用してスライスあたり5〜10μmの厚さでEDには、次の日、。一般的にピールアウェイモールドをミクロトームステージに対して垂直にマウントされている、とマニュアルコントロールは刃と試料の断面の厚さ、スライサーと配置を設定するために使用されます。
   4. RNA抽出
      
      遺伝子の発現はまた、（例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を経由して）定量的に評価することができる。 3DハイドロゲルからのRNA抽出、以下に与えられているそのうちの例えば、のためのプロトコルは、はるかに単純な2次元の場合とはかなり異なります。
      1. 各3Dハイドロゲルのために認定されたRNaseフリーのエッペンドルフチュー​​ブにラベルを付け、各チューブに500μLトリゾール®試薬を加える。
      2. 透明な溶液が得られるまで手動でハイドロゲルを粉砕する乳棒（組織グラインダー）を使用してください。別のグラインダーがそれぞれの条件のために使用されていることを確認します。
      3. 渦各エッペンドルフは、20秒間のサンプルをホモジナイズする。
      4. 核タンパク質複合体の完全な解離を可能にするために5分間、室温でサンプルをインキュベートする。
      5. 20分間氷上で冷却サンプル
      6. 200μL（1mLあたりトリゾール）各サンプルと渦にクロロホルムを追加。
      7. five分間室温でサンプルをインキュベートする。
      8. 4℃で12,000 xgで試料を遠心℃で15分間。
      9. 新しいエッペンドルフチュー​​ブ（界面領域と低い赤、フェノール - クロロホルム相を回避）するために水相（明確な最上層）を移す。 RNAは、明確な水相に残っています。
      10. RNAの分離と貯蔵のための一般的なテクニックが使用できるようになりました。
      11. 以下のRNA抽出、逆転写酵素とリアルタイムPCR用の市販のキットは、しばしばいくつかの修正（Elisseff ら 、Strehin ら ）で使用されています。

代表的な結果：

光パターン形成ハイドロゲルと、ゲル内の細胞のカプセル化の可視化の代表的な結果については図2-4の（上記のプロトコルで参照される）を参照してください。

図1。3Dカプセル化手順の概要。ダイアグラムのステップは、段階的なプロトコルのセクションのタイトルに対応しています。

シーケンシャルマイケル型加算してラジカル重合を用いて図2。光パターン形成ハイドロゲル。写真反応染料の取り込みにより部分的に架橋ヒドロゲルの光パターニングの（A）の回路図。 （B）サークルやヒアルロン酸ハイドロゲルをパターン化（C）ストライプの透明フィルムのマスク。メタクリルローダミン（MeRhoは）唯一の光にさらされたゲルの領域に組み込まれている。スケールバー= 100μmの。

図3。3Dハイドロゲル中の細胞の可視化。幹細胞は、（）光学顕微鏡または（b）のライブ（緑、カルセインAM）と死んだ（赤、エチジウムホモ二量体A - 1）染色光によって架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルで100万個/ mLにカプセル化して24時間後を介して可視化フリーラジカル機構を開始した。スケールバー= 100μmの。

図4。3Dハイドロゲル中の細胞の可視化。 hMSCsは（ミカエル型メカニズムを介して架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルの1万細胞/ mLのカプセル化は、次の（a）生細胞（カルセインAM）または（b）細胞のアクチン（ローダミンファロイジン）と核（DAPI）五日間染色）ペンダントの接着ペプチドと二官能性タンパク質分解分解ペプチドの架橋剤を使用。スケールバー= 100μmの。

Discussion

記載されているプロトコルはcytocompatible方法で、ハイドロゲルスキャフォールド内の細胞をカプセル化するシンプルかつ強力な方法を表しています。分化と幹細胞は2次元対3次元微小環境で著しく異なる挙動を示すことができるので、そのような技術は特に重要です。であっても材料の注入（例えば、 その場ラジカル重合）、細胞のカプセル化と実行可能性と差別化のための分析を含む治療法のために材料の開発プロセスに役立ちます。説明したシーケンシャル処理は空間的にハイドロゲルの環境を操作するために使用し、その結果、細胞挙動（Khetan らを参照してください。）することができます。

全体的に、記載されているプロトコルの最も重要な要素は、使用されるすべてのソリューションの均質性である。特に、特別な注意が架橋剤溶液の添加後の細胞が均等にプレポリマー溶液に分散されている、と解決策がよくピペットの再懸濁によって混合されるように注意してください。これを確実に失敗すると、セルまたはゲルの構造における局所変形の凝集や腫れにつながることができます。

プロトコルはここで主に細胞をカプセル化するための手順に焦点を提示しながら、それがカプセル化は、通常、2Dシードに書かれている分析のプロトコルにはいくつかの調整が必要かもしれないことにも留意することが重要である。いくつかの例は、ヒドロゲルの細胞を可視化し評価するための例示された。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
I2959	Reagent	Ciba Specialty Chemicals
.2 M Triethanolamine Buffer	Reagent	Sigma-Aldrich	T0449
PBS	Reagent	Invitrogen	14040-117	1x, sterile liquid
Live/Dead staining kit	Reagent	Invitrogen	L3224	Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes
Phalloidin-FITC	Reagent	Sigma-Aldrich	P5282
Rhodamine Phalloidin	Reagent	Invitrogen	R415
DAPI	Reagent	Sigma-Aldrich	D9542
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)	Reagent	Polysciences, Inc.	23591
Bovine Serum Albumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A7030
Tween 20	Reagent	Sigma-Aldrich	P1379
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787
Citrisolv	Reagent	Fisher Scientific	22-143975
Micro-cut paraffin	Reagent	Polysciences, Inc.	24202
Trizol reagent	Reagent	Invitrogen	15596-026
0.22 μm pore size nylon syringe filters	Equipment	Fisher Scientific	09-719C
1 mL disposable syringes	Equipment	BD Biosciences	309602	Cut syringes at consistent height for UV exposure
Wide orifice pipette tips	Equipment	Sigma-Aldrich	P6800
Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter	Equipment	EXFO	S1000
254 nm germicidal UV light source	Equipment			Built into most biological safety cabinets