Summary
Мы представляем протоколов для 3-мерного (3D) инкапсуляции клеток в синтетических гидрогелей. Инкапсуляция процедуры приводится в течение двух распространенных методов сшивания (Michael типа сложения и свет по инициативе свободных радикалов механизмов), а также ряд методов для оценки поведения инкапсулированные клетки.
Abstract
3D инкапсуляции клеток в гидрогели представляет все более важной и популярной техникой для культивирования клеток и в направлении развития конструкции для тканевой инженерии. Эта среда лучше имитирует то, что клетки наблюдать в естественных условиях, по сравнению со стандартными культуры ткани, из ткани, как свойства и 3D-среде. Синтетические полимерные гидрогели водой опухшие сетей, которые могут быть предназначены для стабильной или деградировать в результате гидролиза или протеолиза как новые ткани, сданный на хранение инкапсулированные клетки. Широкий спектр полимеров были исследованы для этих приложений, такие как поли (этиленгликоля) и гиалуроновой кислоты. Чаще всего, полимер функционализированных с реактивными группами, такими как метакрилаты или акрилатов способны подвергаться сшивания помощью различных механизмов. В последнее десятилетие значительный прогресс был достигнут в машиностроении этих микросреды - например, через физические или кулон ковалентные включение биохимические сигналы - для повышения жизнеспособности и прямых сотовых фенотипом, включая дифференциацию инкапсулированные стволовых клеток (Бердик и соавт.).
Следующие методы для 3D инкапсуляции клеток были оптимизированы в нашей и других лабораториях, максимально cytocompatibility и свести к минимуму количество шагов гидрогеля обработки. В следующих протоколов (см. рисунок 1 для иллюстрации процедуры), предполагается, что функционализированных полимеров, способных к сшивания уже в руке; отличные отзывы химии полимеров применительно к области тканевой инженерии можно найти в другом месте (Бердик и др.). и эти методы, совместимые с различными типами полимера. Кроме того, Майкл типа того (см. Lutolf и соавт.) И легкой инициированной свободными радикалами (см. Elisseeff и др.). Механизмов сосредоточено здесь составляют лишь небольшую часть сообщили методы сшивания. Смешанные сшивания режим, в котором часть реактивных групп сначала потребляемые того сшивание и следовал по радикальному механизму, является еще одним распространенным и мощная парадигма для направления фенотип инкапсулированные клетки (Khetan и соавт., Салинас и соавт.).
Protocol
А. Подготовка материалов и стерилизации
- До подготовки материалов инкапсуляции, подготовить 0,5% решение фотоинициатора Irgacure 2959 (I2959) в фосфатном буферном растворе (PBS), путем смешивания и инкубации в течение нескольких дней при температуре 37 ° C. Решение может быть шприц фильтруется для стерилизации и хранить при комнатной температуре в течение длительного использования.
- На основе нужной композиции гелей, которые будут обобщены, вычислить (с помощью электронных таблиц, таких как Microsoft Excel) веса полимера и сшивающего необходимости. Из данного веса полимера должны быть растворены в общем объеме определены для достижения желаемой концентрации в гидрогели, сшивающий агент и раствора полимера часть от общего объема геля должны быть определены с помощью электронных таблиц. Подобные расчеты должны быть сделаны, если какой-либо кулон фрагментов (например, клей или РГД YGSR содержащие олигопептид) должны быть включены до сшивания.
- Взвесьте необходимое количество полимера и сшивающего агента и поместить в пробирки Эппендорф. Отрегулируйте расчета таблицы соответственно для фактического веса полимера. (Примечание: объемы могут быть изменены, чтобы компенсировать фактической массы полимера и сшивающего получается).
- Подготовка гель формы с помощью лезвия бритвы, чтобы сократить вершины прочь индивидуальной упаковке 1 мл стерильного одноразового шприца. Обеспечить плоский отруб делается для пресс-форм, которые будут использоваться для гелей photopatterned.
- Место шприца пресс-форм, Эппендорф труб (с крышками открытых) и любые другие необходимые материалы под бактерицидной источник света (как правило, встроенные в шкафы биологической безопасности) и стерилизовать в течение 30 минут.
Б. Подготовка сотовый
- После стерилизации, добавить соответствующие стерильные объемом буфера (на таблицу расчетов, в то время выбор буфера может варьироваться, PBS и слабые буфера основания, такого как триэтаноламин, как правило, используются для свободных радикалов и Майкл типа сшивания, соответственно) с полимером и Эппендорф (опционально) кулон часть должны быть включены (например, клей пептид) и вихревые распустить (если вортексе вне стерильных обернуть капот Эппендорф с парафильмом).
- Добавьте соответствующий объем раствора фрагмент кулон в раствор полимера и обернуть печать с парафильмом. Кратко вихря и инкубировать при температуре 37 ° С до реагирует (если это возможно, на вершине поворотные пластины размешать) во время клеточного препарата. Это включает в себя реакцию на тиоловые пептид (через цистеин группы) акрилат или метакрилат, так что пептид включены в качестве кулона группы в конечном гидрогеля.
- Trypsinize и посчитать клетки и отдельных на порции содержащие необходимое количество для каждого набора гелей. Например, для набора из трех 50 мкл гели при плотности 10 млн. кл / мл, отдельные 1500000 клеток в отдельных конической трубе. Рекомендуется не более 4-гели быть подготовлены в индивидуальный набор из-за времени гелеобразования (обратите внимание: если синтеза нескольких наборов гелей, содержащих одну Эппендорф адекватного объема раствора полимера для всех множеств может быть подготовлен).
- Центрифуга клеток.
- Хотя клетки вращаются вниз
- Свет инициировал свободных радикалов сшивания: добавить 0,5% I2959 решение полимерного раствора равна 10% от общего объема набор геля (для конечной концентрации инициатора 0,05%).
- Майкл-типа (дополнение) сшивания: добавить буфер для сшивателя для достижения соответствующей концентрации раствора.
- Для последовательного сшивания: эти гели включают оба типа сшивания и требуют оба предыдущих шагах.
С. Формирование Гидрогель
- Аспирируйте супернатант из центрифугировали части клетки. Подождите, пока жидкость урегулировать после первоначального стремления и повторно аспирата удалить как можно больше средств массовой информации насколько возможно, не нарушая клеточный осадок.
- Ресуспендируют осадок клеток с полимерным раствором, пока клетки равномерно распределены. Свернуть образования пузырьков медленным пипетки раствор вверх и вниз (примерно 10 циклов должно быть достаточным для распространения клеток).
- Сшивание Гидрогели
- Свет инициировал свободных радикалов сшивания: Алиготе соответствующий объем в формы наконечника шприца. Expose шприцы к ультрафиолетовому излучению для радикального сшивания (например, 10 минут воздействия до 365 нм, 4 мВт/см2 ультрафиолетового излучения является общим для акрилатных функционализированных полимеров). Этот шаг должен выполняться быстро, чтобы минимизировать ячейки урегулирования до ультрафиолетового облучения светом.
- Майкл-типа (дополнение) сшивания: Использование широкого отверстия пипетки, добавьте соответствующий объем сшивателя решение полимер / элемент решения, установить пипеткой желаемого индивидуального объема геля, пипетка раствор вверх и внизгомогенизации и аликвоту в формы наконечника шприца. Этот шаг должен выполняться быстро, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Разрешить 10-30 минут (в зависимости от индивидуальной системы) инкубации в культуре капот для сшивания.
- Последовательное сшивание: Это включает в себя Майкл типа реакции присоединения, а затем воздействие света на второй сшивания. Лишь небольшая часть теоретических сшивки должна быть реакция в течение первых сшивания, а затем стерильной маски следует наносить непосредственно на поверхность геля до освещенности использованием стерилизованных пинцетом. Функционализированных красителя (например, methacrylated родамин (MeRho) в конечной концентрации в геле 20 нМ), также могут быть добавлены в исходном растворе для визуализации рисунка, так как она будет включать преимущественно в радикально сшитый регионов гель (рис. 2 ).
Д. культуры клеток и анализа
- После сшивания, окунуться гели в лунки пластины тканевой культуры средах для инкубации и анализа (см. следующие шаги).
- Клетки могут быть визуализированы для морфологии с использованием световой микроскопии (рис. 3, как правило, синтезированные гидрогели прозрачный) и жизнеспособность использованием флуоресцентных живых / мертвых окрашивания комплект (рис. 3 и 4). Окрашивание для сотовых актина (например, родамин или флуоресцеин помечены фаллоидином) и ядер (например, 4'-6-Diamidino-2-фенилиндола (DAPI)) может быть выполнено с использованием стандартных фиксации и пермеабилизации процедур (рис. 4) со следующей процедурой.
- Промыть конструкций 3X в течение 5 мин с PBS.
- Fix гели путем инкубации в 1 мл 4% формальдегида в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Промыть конструкций 3X с блокировкой раствор, содержащий 3% (м / о) BSA и 0,5% (м / о) Твин в PBS.
- Permeabilize мембраны с 0,25% (м / о) Тритон Х в блокировании решения в течение 20 мин.
- Промыть конструкций 3X с блокирующим раствором.
- Пятно для F-актина с 0,66 мкг / мл FITC или родамин фаллоидином в блокировании решения в течение двух часов при комнатной температуре.
- Промыть 3x с блокирующим раствором.
- Пятно сотовой ядер с использованием 0,4 мкл / мл DAPI в PBS в течение 20 мин.
- Промыть 3X с PBS.
- Визуализация клеток с использованием epifluorescent или конфокальной микроскопии.
- Пролиферации клеток в гели обычно оценивается с помощью коммерчески доступных тестов (например, общая ДНК или биохимического состава). PicoGreen является широко используемым и чувствительным флуоресцентные нуклеиновой кислоты пятно для количественного двухцепочечной ДНК (Певец и соавт.). Клетки могут также учитываться и нормированы на начальное число управление с помощью визуализации методы, описанные в шаге 2.
- Гистологическое секционирования и окрашивание также может быть использован для визуализации клеток и формируется матрица. Следующие протокол для обезвоживания и секционирования 3D гидрогели могут быть использованы для получения поперечного сечения ломтиками на стеклах:
- Фиксация и обезвоживание
- Промыть образец 3X в PBS.
- Исправлена ошибка, при 5 - 30 минут в 4% параформальдегида.
- Промыть образец 3X в PBS.
- Инкубируйте образца в этаноле при 25 ° С в течение 1 часа при каждом из следующих этанола (об. / об) концентрации в воде (по порядку): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (В этот момент, образцы может храниться в течение ночи при 25 ° С).
- Расчистка и инфильтрация
- Трансфер до 100% Citrisolv в течение 1 часа при 25 ° С, а затем на один час при температуре 65 ° C.
- Вырезать образцы пополам с лезвием в чашке Петри, что сечение образец подвергается воздействию.
- Трансфер в смеси 1:1 Citrisolv / Micro-среза Парафин в течение 1 часа при температуре 65 ° C.
- Трансфер до 100% микро-вырезать Парафин в течение 1 часа при температуре 65 ° C.
- Трансфер до 100% микро-вырезать Парафин в течение ночи при температуре 65 ° C.
- Трансфер до 100% микро-вырезать Парафин в течение 1-2 часов при температуре 65 ° C.
- Вложения
- Позиция образца в кожуре наклона формы со 100% парафина.
- Нанесите небольшое количество воска в форме кровати, и вставить две половинки образца с сечением вниз.
- Применить фильтр верхней части
- Добавить дополнительные воска, чтобы погрузить верхнюю часть и дать затвердеть в течение ~ 10 минут.
- Передача вставки до 4 ° C холодильник, чтобы образец, чтобы укрепиться в одночасье.
- Образец может быть разделред следующий день, как правило, на 5-10 мкм в толщину среза с использованием коммерчески доступных микротомы. Как правило кожуры наклона формы устанавливается вертикально, прижимая микротома стадии, и ручного управления используются для установки раздел толщины среза и выравнивание образца с лезвием.
- Добыча РНК
Экспрессия генов также могут быть оценены количественно (например, с помощью реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР)). Протокол для выделения РНК из гидрогелей 3D, пример которой приводится ниже, довольно сильно отличается от более простой 2D случае.- Этикетка сертифицированных РНКазы свободной Эппендорф трубки для каждого 3D-гидрогеля и добавьте 500 мкл Trizol ® реагента в каждую пробирку.
- Используйте пестиком (ткани мясорубку), чтобы вручную молоть гидрогелей до получения прозрачного раствора. Обеспечить различные шлифовальные используются для каждого условия.
- Vortex каждого Эппендорф в течение 20 секунд с целью гомогенизации образцов.
- Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы позволить полной диссоциации нуклеопротеида комплексов.
- Прохладный образцы на льду в течение 20 мин
- Добавьте 200 мкл (в мл Trizol) хлороформа к каждому образцу и вихря.
- Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение пяти минут.
- Центрифуга образцов при 12 000 мкг при 4 ° С в течение 15 мин.
- Передача водной фазы (прозрачный верхний слой) к новым Эппендорф труб (избегая межфазной области и нижней красной, фенол-хлороформ фаза). РНК остается в открытом виде водной фазе.
- Общие методы для РНК изоляции и хранения теперь может быть использован.
- После экстракции РНК, имеющиеся в продаже наборы для обратной транскриптазы и ПЦР в реальном времени, часто используются с некоторыми изменениями (Elisseff и соавт., Strehin и соавт.).
- Фиксация и обезвоживание
Представитель Результаты:
См. рисунки 2-4 (как указано в перечисленных протоколов) для представителя результатов визуализации photopatterned гидрогелей и инкапсуляции клеток в гелях.
Рисунок 1. Обзор 3D процедуры инкапсуляции. Диаграмма шаги соответствуют названия разделов в ступенчатом протоколов.
Рисунок 2. Photopatterned гидрогеля использованием последовательной Майкл типа того, то радикальной полимеризации. () Схема photopatterning частично сшитый гидрогель с включением красителей реактивной фотографии. (B) Круг или (C) полосой прозрачная пленка маска узорной гиалуроновой кислоты гидрогелей. Methacrylated родамин (MeRho) зарегистрировано только в регионах геля, которые были под воздействием света. Шкала бар = 100 мкм.
Рисунок 3. Визуализация клеток в 3D гидрогелей. Стволовые клетки визуализируется с помощью () световой микроскопии или (б) живут (зеленый, кальцеин AM) и мертвых (красный, этидия гомодимера-1) окрашивания 24 часов после инкапсуляции на 1 млн. клеток / мл в гиалуроновой кислоты гидрогель сшитый через свет инициировал свободных радикалов механизма. Шкала бар = 100 мкм.
Рисунок 4. Визуализация клеток в 3D гидрогелей. hMSCs окрашивают в течение () живых клеток (кальцеин AM) или (б) сотовой актина (родамин фаллоидином) и ядер (DAPI) пять дней после инкапсуляции на 1 млн. клеток / мл в гиалуроновой кислоты гидрогель сшитый через Майкл типа механизма ( использование подвесных клей пептидов и бифункциональных протеолитически разложению сшивателей пептид). Шкала бар = 100 мкм.
Discussion
Описаны протоколы представляют собой простой и мощный способ инкапсуляции клеток в гидрогель лесов в cytocompatible образом. Такие методы особенно важны, так как терминально дифференцированные и стволовые клетки могут проявлять поведение заметно отличается в 2D по сравнению с 3D микросреды. Даже для использования в терапевтических подходов, включающих внедрение материалов (например, на месте радикальной полимеризации), ячейка инкапсуляции и анализ на жизнеспособность и дифференциация может помочь в процессе разработки материала. Описаны последовательный процесс может быть использован для управления пространственно гидрогеля окружающей среды, и, следовательно сотовой поведения (см. Khetan и соавт.).
В целом, наиболее важным элементом описанных протоколов однородности всех решений используется. В частности, особое внимание должно уделяться обеспечению клетки равномерно распределены в форполимер решение, и это решение хорошо перемешивается ресуспендирования пипетки после добавления сшивателя решение. Будучи не в состоянии обеспечить это может привести к слипания клеток или локальные изменения в структуре геля и отек.
Хотя протоколы, представленные здесь ориентированы прежде всего на процедуру для инкапсуляции клеток, важно отметить также, что инкапсуляция может потребоваться некоторая корректировка для анализа протоколов, которые, как правило, написаны для 2D посева. Некоторые примеры были проиллюстрированы для визуализации и оценки клеток в гидрогелей.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Высшее исследовательский грант на СК и Национального института Хит грант R01EB008722.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| .2 M Triethanolamine Buffer | Reagent | Sigma-Aldrich | T0449 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | 1x, sterile liquid |
| Live/Dead staining kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes |
| Phalloidin-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | P5282 | |
| Rhodamine Phalloidin | Reagent | Invitrogen | R415 | |
| DAPI | Reagent | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho) | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591 | |
| Bovine Serum Albumin | Reagent | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Citrisolv | Reagent | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Micro-cut paraffin | Reagent | Polysciences, Inc. | 24202 | |
| Trizol reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| 0.22 μm pore size nylon syringe filters | Equipment | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 mL disposable syringes | Equipment | BD Biosciences | 309602 | Cut syringes at consistent height for UV exposure |
| Wide orifice pipette tips | Equipment | Sigma-Aldrich | P6800 | |
| Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| 254 nm germicidal UV light source | Equipment | Built into most biological safety cabinets |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).
- Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A.
- Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C.
- Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks. Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).
- Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels. Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells. Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).
- Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels. Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).
- Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels. Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).
