Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

Summary

We presenteren protocollen voor de 3-dimensionale (3D) het inkapselen van de cellen binnen synthetische hydrogels. De inkapseling procedure is beschreven voor de twee meest gebruikte methodes van verknoping (michael-type naast en licht geïnitieerde vrije radicalen mechanismen), evenals een aantal technieken voor het beoordelen van ingekapselde cel gedrag.

Abstract

De 3D-inkapseling van de cellen in hydrogel is een steeds belangrijker en populaire techniek voor het kweken van cellen en op de ontwikkeling van concepten voor tissue engineering. Deze omgeving imiteert beter wat cellen waarnemen in vivo, in vergelijking met standaard weefselkweek, als gevolg van het weefsel-achtige eigenschappen en 3D-omgeving. Synthetische polymere hydrogelen in water opgezwollen netwerken die kunnen worden ontworpen om te worden stabiel zijn of te worden afgebroken door hydrolyse of proteolyse als nieuw weefsel wordt afgezet door de ingekapselde cellen. Een grote verscheidenheid aan polymeren zijn onderzocht voor deze toepassingen, zoals poly (ethyleenglycol) en hyaluronzuur. Meestal wordt het polymeer gefunctionaliseerd met reactieve groepen, zoals methacrylaten of acrylaten kan ondergaan verknopen door middel van verschillende mechanismen. In de afgelopen tien jaar is veel vooruitgang geboekt in de techniek van deze micro-omgevingen - bijvoorbeeld via de fysieke of hanger covalente integratie van biochemische signalen - de levensvatbaarheid en directe cellulaire fenotype, met inbegrip van de differentiatie van stamcellen ingekapselde (. Burdick et al.) te verbeteren.

De volgende methoden voor de 3D inkapselen van de cellen zijn geoptimaliseerd in onze en andere laboratoria om cytocompatibility te maximaliseren en het aantal hydrogel processtappen te minimaliseren. In de volgende protocollen (zie figuur 1 voor een illustratie van de procedure), wordt aangenomen dat gefunctionaliseerde polymeren kan ondergaan verknopen zich al in de hand, uitstekende recensies van de polymeerchemie, zoals toegepast op het gebied van tissue engineering kan elders worden gevonden (Burdick et al..) en deze methoden zijn compatibel met een reeks van polymeer vormen. Verder, de Michael-type naast (zie Lutolf et al..) En licht geïnitieerde vrije radicalen (zie Elisseeff et al..) Mechanismen gericht op het hier vormen slechts een klein deel van de gerapporteerde verknoping technieken. Mixed mode verknoping, waarbij een deel van de reactieve groepen het eerst wordt verbruikt door de toevoeging verknoping en gevolgd door een radicaal-mechanisme, is een andere veel gebruikte en krachtige paradigma voor het richten van het fenotype van de ingekapselde cellen (Khetan et al.., Salinas et al..).

Protocol

A. Materiaal Voorbereiding en Sterilisatie

1. Voorafgaand aan de voorbereiding van inkapseling materialen, bereiden een 0,5 gew% oplossing van de foto-initiator Irgacure 2959 (I2959) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), door het mengen en incubatie gedurende enkele dagen bij 37 ° C. De oplossing kan dan worden gefilterd spuit voor sterilisatie en opgeslagen bij kamertemperatuur langdurig gebruik.
2. Op basis van de gewenste samenstelling van gels worden gesynthetiseerd, te berekenen (met behulp van een spreadsheet programma zoals Microsoft Excel) het gewicht van het polymeer en crosslinker nodig. Omdat een bepaald gewicht van het polymeer moet worden opgelost in een bepaald totaal volume tot een gewenste concentratie te bereiken in de hydrogels, de crosslinker en de polymeeroplossing gedeelten van het totale volume gel moet ook worden bepaald met behulp van de spreadsheet. Vergelijkbare berekeningen moeten worden gemaakt als een hanger groepen (bijvoorbeeld een lijm RGD-of YGSR met oligopeptide) moeten voorafgaand aan de verknoping worden opgenomen.
3. Weeg de benodigde hoeveelheid van het polymeer en crosslinker en plaats in Eppendorf buizen. Dienovereenkomstig aan te passen voor de berekening spreadsheet voor het werkelijke gewicht van het polymeer verkregen. (Opmerking: de volumes kan worden gewijzigd om te compenseren voor de eigen massa van polymeer en crosslinker verkregen).
4. Bereid gel mallen met behulp van een scheermesje naar de toppen afsnijden van individueel verpakte steriele 1 ml wegwerpspuiten. Zorg voor een vlakke snede wordt gemaakt voor mallen worden gebruikt voor photopatterned gels.
5. Plaats de spuit mallen, Eppendorf buizen (met dop open) en alle andere benodigde materialen onder een kiemdodend lichtbron (meestal ingebouwd in biologische veiligheid kasten) en steriliseer gedurende 30 minuten.

B. celpreparaat

1. Na de sterilisatie, voeg de geschikte steriele buffer volume (per spreadsheet berekeningen, terwijl de keuze van de buffer kan variëren, PBS en een zwakke base buffer, zoals triethanolamine worden doorgaans gebruikt voor de vrije radicalen en michael-type crosslinking, respectievelijk) het polymeer Eppendorf en (optioneel) hanger groep te worden opgenomen (bv., lijm peptide) en vortex te ontbinden (als vortexen buiten het steriele kap wikkel de Eppendorf met parafilm).
2. Voeg de juiste hoeveelheid van de hanger groep oplossing voor de polymeeroplossing en wikkel de afdichting met parafilm. Kort vortex en incuberen bij 37 ° C te reageren (indien mogelijk, bovenop een roterende roer plaat) tijdens de celdeling voorbereiding. Het gaat om de reactie van een thiol op een peptide (via cysteïne groep) om een ​​of-methacrylaat, zodat het peptide is opgenomen als een hanger groep in de finale hydrogel.
3. Trypsinize en tellen cellen en scheiden in porties van het juiste nummer voor elke set van gels. Bijvoorbeeld voor een set van drie 50 uL gels bij een dichtheid van 10 miljoen cellen / ml, afzonderlijke 1,5 miljoen cellen in een individuele conische buis. Het wordt aanbevolen om niet meer dan 4 gels worden opgesteld in een individuele set te wijten aan de timing van gelering (let op: als het synthetiseren van meerdere sets van gels, een Eppendorf met een voldoende volume van de polymeer-oplossing voor alle sets kunnen worden bereid).
4. Centrifugeer de cellen.
5. Terwijl de cellen zijn te stoppen met draaien
   1. Light geïnitieerd door vrije radicalen verknoping: voeg 0,5 gew% I2959 oplossing voor de polymeeroplossing die gelijk is aan 10% van het totale gel ingestelde volume (voor een laatste initiator concentratie van 0,05 gew%).
   2. Michael-type (toevoeging) verknopen: voeg buffer aan de crosslinker om de juiste concentratie oplossing te komen.
   3. Voor sequentiële verknoping: deze gels bevatten beide typen van verknoping en vereisen zowel van de vorige stappen.

C. Hydrogel Formation

1. Aspireren supernatans van de gecentrifugeerd cel gedeelte. Wacht tot vloeistof tot rust na de eerste aspiratie en re-aspiratie om zoveel mogelijk media te verwijderen zonder verstoring van de cel pellet.
2. Resuspendeer de celpellet met de polymeeroplossing tot cellen zijn gelijkmatig verdeeld. Minimaliseer blaasvorming door het langzaam pipetteren de oplossing op en neer (ongeveer 10 cycli moet voldoende zijn om cellen te verdelen).
3. Verknoping Hydrogelen
   1. Light geïnitieerd door vrije radicalen verknoping: Aliquot het juiste volume in de spuit tip mallen. Expose de spuiten aan UV-licht voor een radicale verknoping (bijvoorbeeld een 10 minuten blootstelling aan 365 nm, 4 mW/cm2 UV-licht is gebruikelijk dat acrylaat gefunctionaliseerde polymeren). Deze stap moet snel worden uitgevoerd om een ​​minimum te beperken cel regelen voordat UV blootstelling aan licht.
   2. Michael-type (toevoeging) het verknopen: Met behulp van een brede opening pipettip, voeg de juiste hoeveelheid crosslinker oplossing van het polymeer / cel-oplossing, stelt de pipet op de gewenste individuele gel volume, pipet de oplossing op en neer omhomogeniseren, en hoeveelheid in de spuit tip mallen. Deze stap moet snel worden uitgevoerd om een ​​gelijkmatige verdeling van de cellen te verzekeren. Laat 10-30 minuten (afhankelijk van het individuele systeem) incubatie in de cultuur kap voor verknoping.
   3. Sequentiële verknoping: Het gaat om de Michael-type additiereactie en vervolgens blootstelling aan licht voor de tweede verknoping. Slechts een fractie van theoretische crosslinks moet worden gereageerd tijdens de eerste verknoping en vervolgens een steriele masker moet rechtstreeks worden toegepast op de gel oppervlak voorafgaand aan de blootstelling aan het licht met behulp van gesteriliseerde pincet. Een gefunctionaliseerde kleurstof (bv. methacrylated rhodamine (MeRho) bij een uiteindelijke concentratie in de gel van 20 nM) kan ook worden toegevoegd aan de eerste oplossing voor de patronen zichtbaar te maken, omdat het bij voorkeur op te nemen in radicaal verknoopte regio's van de gel (figuur 2 ).

D. Cel Cultuur en Analyse

1. Na de verknoping, duik gels in putten van een weefselkweek plaat met media voor incubatie-en-analyse (zie volgende stappen).
2. Cellen kunnen worden gevisualiseerd voor de morfologie met behulp van licht microscopie (figuur 3, typisch, gesynthetiseerde hydrogels zijn transparant) en de levensvatbaarheid van het gebruik van een TL-live / dode vlekken kit (figuren 3 en 4). Kleuring voor cellulaire actine (bijv. rhodamine of fluoresceïne gelabeld phalloidin) en de kernen (bv, 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) kan worden uitgevoerd met behulp van standaard fixatie en permeabilisatie procedures (figuur 4) met de volgende procedure.
   1. Spoel bouwt 3X gedurende 5 min met PBS.
   2. Fix gels door incubatie in 1 ml 4% formaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Spoel bouwt 3X met blokkerende oplossing van 3% (w / v) BSA en 0,5% (w / v) Tween in PBS.
   4. Permeabilize membraan met 0,25% (w / v) Triton X in het blokkeren van oplossing voor 20 minuten.
   5. Spoel bouwt 3X met het blokkeren van oplossing.
   6. Vlek voor F-actine met 0,66 ug / ml FITC of rhodamine phalloidin in het blokkeren van oplossing voor twee uur bij kamertemperatuur.
   7. Spoel 3x met blokkerende oplossing.
   8. Vlek cellulaire kernen met behulp van 0,4 pl / ml DAPI in PBS gedurende 20 minuten.
   9. Spoel 3X met PBS.
   10. Visualiseer cellen met behulp van epifluorescerende of confocale microscopie.
3. Proliferatie van cellen in gels wordt vaak beoordeeld aan de hand commercieel verkrijgbare testen (bijv. de totale DNA of biochemische inhoud). PicoGreen is een veelgebruikte en gevoelige fluorescente nucleïnezuur vlek voor de kwantificering van double-stranded DNA (Singer et al..). Cellen kunnen ook worden geteld en genormaliseerd op een eerste controle in met de visualisatie methoden beschreven in stap 2.
4. Histologische coupes en kleuren kunnen ook worden gebruikt om cellen te visualiseren en vormde matrix. Het volgende protocol voor de uitdroging en snijden van 3D hydrogelen kan worden gebruikt om cross-sectionele plakken op glas dia's te verkrijgen:
   1. Fixatie en uitdroging
      1. Spoel exemplaar 3X in PBS.
      2. Fix voor 5 - 30 minuten in 4% paraformaldehyde.
      3. Spoel exemplaar 3X in PBS.
      4. Incubeer het monster in EtOH bij 25 ° C gedurende 1 uur bij elk van de volgende EtOH (v / v) concentraties in water (in volgorde): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (op dit punt, monsters 's nachts kan worden bewaard bij 25 ° C).
   2. Clearing en Infiltratie
      1. Transfer naar 100% Citrisolv gedurende 1 uur bij 25 ° C, gevolgd door een uur bij 65 ° C.
      2. Gesneden monsters in de helft met een scheermesje in een petrischaal zodanig dat de doorsnede van het monster wordt blootgesteld.
      3. Transfer naar 1:1 mengsel van Citrisolv / Micro-cut Paraffine gedurende 1 uur bij 65 ° C.
      4. Transfer naar 100% Micro-cut Paraffine gedurende 1 uur bij 65 ° C.
      5. 'S nachts over te dragen aan 100% Micro-cut Paraffine bij 65 ° C.
      6. Transfer naar 100% Micro-cut Paraffine gedurende 1-2 uur bij 65 ° C.
   3. Inbedding
      1. Positie model in peel-away mal met 100% paraffine.
      2. Plaats een kleine hoeveelheid wax in mould bed, en steek de twee helften van het monster met de doorsnede naar beneden.
      3. Van toepassing zijn top filter stuk
         1. Voeg extra wax om onder te duiken de top stuk en laat uitharden voor ~ 10 minuten.
      4. Overdracht inzetstukken tot 4 ° C koelkast, zodat exemplaar te harden 's nachts.
      5. Monster mag worden sectieed de volgende dag, meestal op 5-10 micrometer dikte per stuk met in de handel verkrijgbaar microtomen. Typisch de schil-away mal is verticaal gemonteerd tegen de microtoom podium, en handmatige controles worden gebruikt om de snijdikte, snijmachine en afstemming van het monster met het blad in te stellen.
   4. RNA-extractie
      
      Genexpressie kan ook kwantitatief worden beoordeeld (bijv. via real-time polymerase chain reaction (PCR)). Het protocol voor RNA-extractie uit 3D-hydrogels, een voorbeeld hieronder is weergegeven, is heel anders dan de veel eenvoudiger 2D geval.
      1. Label een gecertificeerd RNAse gratis eppendorfbuisje voor elke 3D-hydrogel en voeg 500 ul TRIzol ® reagens aan elke buis.
      2. Gebruik een stamper (weefsel molen) om handmatig slijpen van de hydrogelen totdat een heldere oplossing wordt verkregen. Zorg ervoor dat de verschillende slijpmachines worden gebruikt voor elke conditie.
      3. Vortex elk Eppendorf gedurende 20 seconden om de monsters te homogeniseren.
      4. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten in beslag dissociatie van nucleoproteïne complexen mogelijk te maken.
      5. Cool monsters op ijs gedurende 20 min.
      6. Voeg 200 ul (per ml TRIzol) chloroform aan elk monster en vortex.
      7. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
      8. Centrifugeer monsters op 12.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
      9. Breng de waterige fase (heldere toplaag) om nieuwe Eppendorf buisjes (het vermijden van grensgebied en lagere rood, fenol-chloroform fase). RNA blijft in de heldere waterige fase.
      10. Gangbare technieken voor RNA-isolatie en-opslag kan nu worden gebruikt.
      11. Na de RNA-extractie, commercieel verkrijgbare kits voor reverse transcriptase en real-time PCR worden vaak gebruikt in combinatie met enkele wijzigingen (Elisseff et al.., Strehin et al..).

Representatieve resultaten:

Zie afbeelding 2-4 (zoals genoemd in de bovenstaande protocollen) voor de representatieve resultaten van de visualisatie van photopatterned hydrogelen en de inkapseling van de cellen in gels.

Figuur 1. Overzicht van de 3D-inkapseling procedure. Diagram stappen komen overeen met sectie-titels in de stapsgewijze protocollen.

Figuur 2. Photopatterned hydrogel met behulp van sequentiële Michael-type naast dan radicaal polymerisatie. (A) Schematische voorstelling van photopatterning van een gedeeltelijk verknoopt hydrogel met integratie van een foto reactieve kleurstof. (B) Circle of (C) streep transparant masker patroon hyaluronzuur hydrogels. Methacrylated rhodamine (MeRho) is opgenomen alleen in regio's van de gel die werden blootgesteld aan licht. Schaal bars = 100 micrometer.

Figuur 3. Visualisatie van cellen in 3D hydrogelen. Stamcellen gevisualiseerd via (a) lichtmicroscopie of (b) live (groen, Calceïne AM) en dode (rood, Ethidium homodimeer-1) kleuring 24 uur na de inkapseling van 1 miljoen cellen / ml in een hyaluronzuur hydrogel verknoopt door middel van een lichte gestart vrije radicalen mechanisme. Schaal bars = 100 micrometer.

Figuur 4. Visualisatie van cellen in 3D hydrogelen. hMSCs gekleurd voor (a) levende cellen (Calceïne AM) of (b) cellulaire actine (rhodamine phalloidin) en de kernen (DAPI) vijf dagen na de inkapseling van 1 miljoen cellen / ml in een hyaluronzuur hydrogel verknoopt door middel van een Michael-type mechanisme ( met behulp van lijm hanger peptiden en bifunctionele proteolytisch afbreekbare peptide crosslinkers). Schaal bars = 100 micrometer.

Discussion

De beschreven protocollen vormen een eenvoudige en krachtige methode om cellen binnen hydrogel scaffolds in te kapselen in een cytocompatible manier. Dergelijke technieken zijn vooral belangrijk omdat terminaal gedifferentieerde en stamcellen kunnen duidelijk verschillend gedrag vertonen in 2D versus 3D micro-omgevingen. Zelfs voor therapeutische benaderingen met betrekking tot de inplanting van materialen (bijvoorbeeld, in situ radicaal polymerisatie), cel inkapseling en analyse voor de levensvatbaarheid en differentiatie kan helpen in het materiaal ontwikkelingsproces. De beschreven sequentieel proces kan worden gebruikt om ruimtelijk manipuleren van de hydrogel-omgeving, en dus cellulaire gedrag (zie Khetan et al..).

Over het geheel genomen de meest kritische element van de beschreven protocollen is de homogeniteit van alle gebruikte oplossingen. In het bijzonder moet speciale zorg worden genomen om ervoor te zorgen cellen zijn gelijkmatig verdeeld in het prepolymeer oplossing, en dat de oplossing goed gemengd is met een pipet resuspensie na toevoeging van de crosslinker oplossing. Niet om dit te verzekeren kan leiden tot samenklontering van cellen of lokale variaties in de gel-structuur en de zwelling.

Terwijl de protocollen hier gepresenteerde richten zich primair op de procedure voor het inkapselen van cellen, is het belangrijk om ook rekening mee dat inkapselen kunnen sommige aanpassingen noodzakelijk om de analyse protocollen die typisch zijn geschreven voor 2D zaaien. Enkele voorbeelden werden geïllustreerd voor het visualiseren en beoordelen van cellen in hydrogelen.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
I2959	Reagent	Ciba Specialty Chemicals
.2 M Triethanolamine Buffer	Reagent	Sigma-Aldrich	T0449
PBS	Reagent	Invitrogen	14040-117	1x, sterile liquid
Live/Dead staining kit	Reagent	Invitrogen	L3224	Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes
Phalloidin-FITC	Reagent	Sigma-Aldrich	P5282
Rhodamine Phalloidin	Reagent	Invitrogen	R415
DAPI	Reagent	Sigma-Aldrich	D9542
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)	Reagent	Polysciences, Inc.	23591
Bovine Serum Albumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A7030
Tween 20	Reagent	Sigma-Aldrich	P1379
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787
Citrisolv	Reagent	Fisher Scientific	22-143975
Micro-cut paraffin	Reagent	Polysciences, Inc.	24202
Trizol reagent	Reagent	Invitrogen	15596-026
0.22 μm pore size nylon syringe filters	Equipment	Fisher Scientific	09-719C
1 mL disposable syringes	Equipment	BD Biosciences	309602	Cut syringes at consistent height for UV exposure
Wide orifice pipette tips	Equipment	Sigma-Aldrich	P6800
Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter	Equipment	EXFO	S1000
254 nm germicidal UV light source	Equipment			Built into most biological safety cabinets