Summary
Wir präsentieren Protokolle für die 3-dimensionale (3D) Verkapselung von Zellen innerhalb synthetischen Hydrogelen. Die Kapselung Verfahren ist für zwei häufig verwendete Methoden der Vernetzung (Michael-Addition und Licht-initiierte radikalische Mechanismen), sowie eine Reihe von Techniken für die Beurteilung der eingekapselten Zellen Verhalten skizziert.
Abstract
Die 3D-Verkapselung von Zellen innerhalb Hydrogele stellt eine zunehmend wichtige und populäre Technik zur Kultivierung von Zellen und zur Entwicklung der Konstrukte für das Tissue Engineering. Dieses Umfeld besser nachahmt, welche Zellen in vivo zu beobachten, im Vergleich zu Standard-Gewebekultur, aufgrund der Gewebe-ähnliche Eigenschaften und 3D-Umgebung. Synthetische polymere Hydrogele sind in Wasser gequollenen Netzwerke entwickelt, um stabil sein oder durch Hydrolyse oder Proteolyse abgebaut als neue Gewebe eingekapselten Zellen abgelagert wird, kann sein. Eine Vielzahl von Polymeren haben für diese Anwendungen, wie Poly (Ethylenglycol) und Hyaluronsäure untersucht. Am häufigsten wird das Polymer mit reaktiven Gruppen wie Methacrylate oder Acrylate Lage sind, eine Vernetzung über verschiedene Mechanismen funktionalisiert. In den letzten zehn Jahren wurden große Fortschritte in der Technik dieser Mikroumgebungen gemacht worden - z. B. über die körperliche oder Anhänger kovalenten Einbau von biochemischen Signale - die Rentabilität und direkte zelluläre Phänotyp, einschließlich der Differenzierung von verkapselten Stammzellen (. Burdick et al) zu verbessern.
Die folgenden Methoden für die 3D-Verkapselung von Zellen in unserem und anderen Laboratorien optimiert worden, um cytocompatibility zu maximieren und minimieren die Anzahl der Hydrogel Verarbeitungsschritte. In den folgenden Protokollen (siehe Abbildung 1 finden Sie eine Abbildung des Verfahrens), wird davon ausgegangen, dass funktionalisierte Polymere Lage sind, eine Vernetzung bereits in der Hand, hervorragende Bewertungen der Polymerchemie wie auf dem Gebiet des Tissue Engineering angewendet werden können an anderer Stelle gefunden werden (Burdick et al.) und diese Methoden sind kompatibel mit einer Reihe von Polymer-Typen. Darüber hinaus bilden die Michael-Addition (siehe Lütolf et al.) Und Licht-initiierte radikalische (siehe Elisseeff et al.) Mechanismen hier konzentrierte sich nur ein kleiner Teil der gemeldeten Vernetzung Techniken. Mixed-Modus Vernetzung, in dem ein Teil der reaktiven Gruppen zunächst durch Zusatz Vernetzung verbraucht wird, gefolgt von einem radikalischen Mechanismus ist eine weitere häufig eingesetzte und mächtiges Paradigma für die Leitung der Phänotyp der verkapselten Zellen (Khetan et al., Salinas et al.).
Protocol
A. Material Vorbereitung und Sterilisation
- Vor der Vorbereitung Verkapselungsmaterialien, bereiten eine 0,5% ige Lösung des Photoinitiators Irgacure 2959 (I2959) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), die durch Mischen und Inkubation für mehrere Tage bei 37 ° C. Die Lösung kann dann Spritze gefiltert zur Sterilisation und Lagerung bei Raumtemperatur für langfristigen Einsatz sein.
- Basierend auf der gewünschten Zusammensetzung der Gele synthetisiert werden, berechnen (mit einem Tabellenkalkulationsprogramm wie Microsoft Excel) das Gewicht von Polymer und Vernetzer benötigt. Weil ein gegebenes Gewicht des Polymers in einem definierten Volumen auf eine gewünschte Konzentration in den Hydrogelen, der Vernetzer und Polymerlösung Teile des gesamten Gel-Volumen zu erreichen aufgelöst sind, ist auch anhand der Tabelle sein. Ähnliche Berechnungen sollte erfolgen, wenn alle Anhänger-Einheiten (z. B. ein Klebstoff RGD oder YGSR mit Oligopeptid) vor der Vernetzung mit einbezogen werden sollen.
- Wiegen Sie die benötigte Menge an Polymer und Vernetzer und Platz in Eppendorf-Röhrchen. Stellen Sie die Berechnung Tabellenkalkulation entsprechend für das tatsächliche Gewicht des Polymers. (Hinweis: Die Bände können geändert werden, um für die eigentliche Masse des Polymers und Vernetzer erhalten zu kompensieren).
- Bereiten Gelformen mit einer Rasierklinge zu den Spitzen abgeschnitten von einzeln verpackt sterile 1 ml Einwegspritzen. Stellen Sie sicher, einen flachen Schnitt ist für Formen für photostrukturierten Gele einsetzbar zu machen.
- Legen Sie die Spritze Formen, Eppendorf-Röhrchen (mit Deckeln offen) und alle anderen benötigten Materialien unter einer keimtötende Lichtquelle (in der Regel in biologische Sicherheitswerkbänke gebaut) und sterilisieren für 30 Minuten.
B. Cell Preparation
- Nach der Sterilisation, fügen Sie die entsprechende sterile Puffervolumen (pro Tabellenkalkulation, während die Wahl der Puffer kann variieren, PBS und einer schwachen Base-Puffer wie Triethanolamin sind in der Regel für freie Radikale und Michael-Vernetzung, bzw. verwendet), um das Polymer Eppendorf und (optional) Anhänger Einheit einbezogen werden (zB Kleber-Peptid) und Vortex zu lösen (wenn Vortexen außerhalb des sterilen Haube wickeln die Eppendorf mit Parafilm).
- Fügen Sie die entsprechenden Volumen des Anhängers Einheit Lösung für die Polymer-Lösung und wickeln Sie die Dichtung mit Parafilm. Kurz vortexen und bei 37 ° C zu reagieren (wenn möglich, auf einem rotierenden Rührplatte) während der Zellteilung Vorbereitung. Dies beinhaltet die Reaktion eines Thiols auf ein Peptid (via Cystein-Gruppe), um ein Acrylat oder Methacrylat, so dass das Peptid als Anhänger Gruppe in den letzten Hydrogel enthalten ist.
- Trypsinize und zählen Zellen und trennen sich in Portionen mit der entsprechenden Anzahl für jede Gruppe von Gelen. Zum Beispiel für einen Satz von drei 50 ul Gele bei einer Dichte von 10 Mio. Zellen / ml, separate 1,5 Millionen Zellen in ein individuelles konischen Rohr. Es wird empfohlen, nicht mehr als 4 Gele in ein individuelles Set aufgrund des Zeitpunkts der Gelierung (Hinweis: Wenn die Synthese mehrerer Gruppen von Gelen, einem Eppendorf, das eine ausreichende Menge von Polymer-Lösung für alle Sets hergestellt werden) hergestellt werden.
- Zentrifugieren Sie die Zellen.
- Während Zellen zum Stillstand
- Licht initiierte radikalische Vernetzung: add 0,5 Gew.% I2959 Lösung für die Polymer-Lösung in Höhe von 10% der gesamten Gel eingestellte Lautstärke (für eine endgültige Initiator-Konzentration von 0,05 wt%).
- Michael-Typ (zusätzlich) Vernetzung: add Puffer, um die Vernetzer auf die geeignete Konzentration Lösung zu erreichen.
- Für sequentielle Vernetzung: diese Gele enthalten beide Arten von Vernetzung und erfordern die beiden vorherigen Schritte.
C. Hydrogelbildung
- Saugen Sie den Überstand der zentrifugierten Zelle Teil. Warten Sie, bis Flüssigkeit nach der ersten Aspiration und wieder absaugen niederlassen, um so viel Medien wie möglich ohne Unterbrechung das Zellpellet zu entfernen.
- Zellpellet mit der Polymerlösung, bis die Zellen gleichmäßig verteilt sind. Minimieren Blasenbildung durch langsames Pipettieren der Lösung nach oben und unten (ca. 10 Zyklen sollte ausreichen, um Zellen zu verteilen).
- Die Vernetzung Hydrogele
- Licht initiierte radikalische Vernetzung: Aliquot das entsprechende Volumen in Spritzenspitze Formen. Expose die Spritzen mit UV-Licht für radikalische Vernetzung (z. B. 10 Minuten Exposition gegenüber 365 nm, 4 mW/cm2 UV-Licht für Acrylat-funktionalisierten Polymeren üblich). Dieser Schritt sollte zügig durchgeführt werden, um zu minimieren Zelle Abrechnung vor UV-Licht ausgesetzt.
- Michael-Typ (zusätzlich) Vernetzung: Mit einer breiten Öffnung Pipettenspitze, fügen Sie die entsprechende Volumen der Vernetzer-Lösung, um das Polymer / Zell-Lösung, setzen Sie die Pipette auf die gewünschte individuelle Gelvolumen, Pipette die Lösung auf und ab, umhomogenisieren und Aliquot in die Spitze der Spritze Formen. Dieser Schritt sollte zügig durchgeführt werden, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Lassen Sie 10-30 Minuten (abhängig von der individuellen System) Inkubation in der Kultur Haube für die Vernetzung.
- Sequential Vernetzung: Dies beinhaltet die Michael-Addition und dann Kontakt mit der zweiten Vernetzung Licht. Nur ein Bruchteil der theoretischen Vernetzungen sollten während der ersten Vernetzung zur Reaktion gebracht werden und dann eine sterile Maske sollte direkt auf das Gel aufgetragen vor der Belichtung mit sterilisierten Pinzetten werden. Ein funktionalisierten Farbstoff (zB methacrylierte Rhodamin (MeRho) in einer Endkonzentration im Gel von 20 nM) kann auch für die ursprüngliche Lösung für die Strukturierung visualisieren hinzugefügt werden, da es bevorzugt wird einzuarbeiten radikal vernetzten Regionen des Gels (Abbildung 2 ).
D. Cell Culture and Analysis
- Nach Vernetzung stürzen Gele in die Vertiefungen einer Gewebekultur Platte mit Medien für die Inkubation und Analyse (siehe folgende Schritte).
- Die Zellen können visualisiert werden für Morphologie mit Hilfe von Licht-Mikroskopie (Abbildung 3; typischerweise synthetisiert werden Hydrogele transparent) und die Lebensfähigkeit mit einem fluoreszierenden Live / Dead Färbekit (Abb. 3 und 4). Die Färbung der zellulären Aktin (zB Rhodamin oder Fluorescein Phalloidin) und Kerne (z. B., 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) kann mit Standard-Fixierung und Permeabilisierung Verfahren (Abbildung 4) mit dem folgenden Verfahren werden.
- Spülen Konstrukte 3x für 5 min mit PBS.
- Fix Gele durch Inkubation in 1 ml 4% Formaldehyd für 30 min bei Raumtemperatur.
- Spülen Konstrukte 3X mit Blocking-Lösung mit 3% (w / v) BSA und 0,5% (w / v) Tween in PBS.
- Permeabilisieren Membran mit 0,25% (w / v) Triton X in Blocking-Lösung für 20 min.
- Spülen Konstrukte 3X mit Blocking-Lösung.
- Stain für F-Aktin mit 0,66 ug / ml FITC oder Rhodamin-Phalloidin in Blocking-Lösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie 3x mit Blocking-Lösung.
- Stain Zellkernen mit 0,4 ul / ml DAPI in PBS für 20 min.
- Spülen Sie 3X mit PBS.
- Visualisieren Sie Zellen mit epifluoreszenten oder konfokalen Mikroskopie.
- Proliferation von Zellen in Gelen wird allgemein beurteilt Verwendung von kommerziell erhältlichen Assays (zB Gesamt-DNA oder biochemische Inhalt). PicoGreen ist eine häufig verwendete und empfindliche fluoreszierende Nukleinsäure Fleck für die Quantifizierung von doppelsträngigen DNA (Singer et al.). Zellen können auch gezählt werden und normalisiert, um eine erste Kontrolle Nummer über die Visualisierungs-Methoden in Schritt 2 beschrieben.
- Histologische Schnitte und Färbung kann auch dazu verwendet, um Zellen zu visualisieren und zu gebildet Matrix. Das folgende Protokoll für die Dehydratisierung und Schneiden von 3D-Hydrogele verwendet werden, um Querschnitts-Scheiben auf Glasplättchen zu erhalten:
- Fixation und Entwässerung
- Rinse Probe 3X in PBS.
- Fix für 5 bis 30 Minuten in 4% Paraformaldehyd.
- Rinse Probe 3X in PBS.
- Inkubieren Sie die Probe in EtOH bei 25 ° C für 1 Stunde bei jeder der folgenden EtOH (v / v)-Konzentrationen in Wasser (in Reihenfolge): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (An dieser Stelle Proben kann über Nacht bei 25 ° C gelagert werden).
- Clearing und Infiltration
- Transfer zum 100% Citrisolv für 1 Stunde bei 25 ° C, um eine Stunde bei 65 ° C.
- Cut-Proben in zwei Hälften mit einer Rasierklinge in einer Petrischale, so dass der Querschnitt der Probe ausgesetzt ist.
- Transfer zum 1:1-Gemisch aus Citrisolv / Micro-cut Paraffin für 1 Stunde bei 65 ° C.
- Transfer zum 100% Micro-cut Paraffin für 1 Stunde bei 65 ° C.
- Transfer zum 100% Micro-cut Paraffin über Nacht bei 65 ° C.
- Transfer zum 100% Micro-cut Paraffin für 1-2 Stunden bei 65 ° C.
- Embedding
- Position Probe in peel-away Form mit 100% Paraffin.
- Legen Sie eine kleine Menge Wachs in Form Bett, und legen Sie die beiden Hälften der Probe mit dem Querschnitt nach unten.
- Bewerben Aufsatzfilter Stück
- Fügen Sie zusätzliche Wachs zu tauchen das Oberteil und erhärten lassen für ~ 10 Minuten.
- Transfer-Einsätze bis 4 ° C Kühlschrank, damit Probe zu verhärten über Nacht.
- Probe kann Abschnitt werdened am nächsten Tag, in der Regel bei 5-10 mu m Dicke pro Scheibe mit handelsüblichen Mikrotome. Typischerweise ist die Peel-away Form wird vertikal gegen die Mikrotom Bühne montiert und manuelle Kontrollen dienen dazu, die Schnittdicke, Schneidemaschine und Ausrichtung der Probe mit der Klinge gesetzt.
- RNA-Extraktion
Die Genexpression kann auch quantitativ bewertet werden (zB über real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR)). Das Protokoll für die RNA-Extraktion aus 3D-Hydrogele, von denen ein Beispiel nachstehend wiedergegeben ist, ist ganz anders als die viel einfacher 2D-Fall.- Beschriften Sie eine zertifizierte RNAse freien Eppendorf-Röhrchen für jeden 3D-Hydrogel und fügen 500 mL Trizol ®-Reagenz in jedes Röhrchen.
- Verwenden Sie einen Stößel (tissue Schleifer) manuell zu mahlen die Hydrogele, bis eine klare Lösung erhalten wird. Stellen Sie sicher, verschiedene Mühlen sind für jede Bedingung verwendet.
- Vortex jedes Eppendorf für 20 Sekunden zu homogenisieren die Proben.
- Inkubieren Proben bei Raumtemperatur für fünf Minuten in Anspruch Dissoziation Nukleoproteinkomplexe ermöglichen.
- Coole Proben auf Eis für 20 min
- Geben Sie 200 ul (pro ml Trizol) Chloroform zu jeder Probe und vortexen.
- Inkubieren Proben bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
- Centrifuge Proben bei 12.000 xg bei 4 ° C für 15 min.
- Übertragen Sie die wässrige Phase (klare obere Schicht), um neue Eppendorf-Röhrchen (Vermeidung von Grenz-Region und eine untere rote Phenol-Chloroform-Phase). RNA bleibt in der klaren wäßrigen Phase.
- Gemeinsame Verfahren zur RNA-Isolierung und-speicherung kann nun verwendet werden.
- Nach RNA-Extraktion, kommerziell erhältlichen Kits für Reverse-Transkriptase-und real-time PCR werden oft mit einigen Modifikationen (Elisseff et al. Strehin et al.) Verwendet.
- Fixation und Entwässerung
Repräsentative Ergebnisse:
Siehe Abbildungen 2-4 (wie in der oben genannten Protokolle verwiesen) für repräsentative Ergebnisse der Visualisierung von photostrukturierten Hydrogele und Verkapselung von Zellen in Gelen.
Abbildung 1. Übersicht über die 3D-Kapselung Verfahren. Diagramm Schritte zum Abschnittstitel in der schrittweisen Protokolle entsprechen.
Abbildung 2. Photostrukturierbare Hydrogel mit sequentieller Michael-Addition dann radikalische Polymerisation. (A) Schematische Darstellung der Photostrukturierungsverfahren eines partiell vernetzten Hydrogel mit Einbau eines Foto Reaktivfarbstoff. (B) Circle oder (C) Streifen Transparenz Filmmaske Hyaluronsäure Hydrogele gemustert. Methacrylierte Rhodamin (MeRho) ist nur in Regionen des Gels, die dem Licht ausgesetzt wurden eingearbeitet. Maßstabsbalken = 100 um.
Abbildung 3. Visualisierung von Zellen in 3D-Hydrogele. Stammzellen visualisiert via (a) Lichtmikroskopie oder (b) leben (grün, Calcein AM) und tote (rot, Ethidium Homodimer-1)-Färbung von 24 Stunden nach Verkapselung bei 1 Mio. Zellen / ml in einem Hyaluronsäure-Hydrogel durch ein Licht vernetzt initiiert radikalischen Mechanismus. Maßstabsbalken = 100 um.
Abbildung 4. Visualisierung von Zellen in 3D-Hydrogele. hMSCs für (a) lebende Zellen (Calcein AM) oder (b) zelluläre Aktin (Rhodamin-Phalloidin) und Kerne (DAPI) fünf Tagen nach Verkapselung bei 1 Mio. Zellen / ml in einem Hyaluronsäure-Hydrogel durch eine Michael-Mechanismus vernetzt gefärbt ( mit Anhänger Klebstoff Peptiden und bifunktionellen proteolytisch abbaubar Peptid Vernetzer). Maßstabsbalken = 100 um.
Discussion
Die beschriebenen Protokolle stellen eine einfache und kraftvolle Methode, um Zellen in Hydrogel Gerüste in einem cytocompatible Weise kapseln. Solche Techniken sind besonders wichtig, da ausdifferenzierten und Stammzellen können deutlich unterschiedliche Verhalten in 2D versus 3D Mikroumgebungen aufweisen. Selbst für therapeutische Ansätze, die die Implantation von Materialien (z. B. in situ Radikalpolymerisation), der Verkapselung von Zellen und Analysen für die Lebensfähigkeit und die Differenzierung in der materiellen Entwicklung Prozess zu helfen. Die beschriebenen sequentiellen Verfahren lassen sich räumlich zu manipulieren das Hydrogel Umwelt, und damit zelluläre Verhalten (siehe Khetan et al.).
Insgesamt ist das wichtigste Element der beschriebenen Protokolle der Homogenität aller Lösungen verwendet. Insbesondere ist besondere Vorsicht geboten, um sicherzustellen, Zellen gleichmäßig in der Präpolymerlösung verteilt, und dass die Lösung gut gemischt mit einer Pipette Resuspension nach Zugabe der Vernetzer-Lösung sein. Wird auf diese sicherstellen können, um von Zellen oder lokale Variationen in Gelstruktur und Schwellungen Verklumpung führen.
Während die Protokolle hier vorgestellten konzentrieren sich vor allem über das Verfahren zur Verkapselung von Zellen, ist es wichtig, auch beachten, dass die Verkapselung eine gewisse Anpassung der Analyse-Protokolle, die typischerweise für 2D-Seeding geschrieben erfordern. Mehrere Beispiele wurden für die Visualisierung und Beurteilung Zellen in Hydrogelen illustriert.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship an SK und National Institutes of Heath gewähren R01EB008722 unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| .2 M Triethanolamine Buffer | Reagent | Sigma-Aldrich | T0449 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | 1x, sterile liquid |
| Live/Dead staining kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes |
| Phalloidin-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | P5282 | |
| Rhodamine Phalloidin | Reagent | Invitrogen | R415 | |
| DAPI | Reagent | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho) | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591 | |
| Bovine Serum Albumin | Reagent | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Citrisolv | Reagent | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Micro-cut paraffin | Reagent | Polysciences, Inc. | 24202 | |
| Trizol reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| 0.22 μm pore size nylon syringe filters | Equipment | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 mL disposable syringes | Equipment | BD Biosciences | 309602 | Cut syringes at consistent height for UV exposure |
| Wide orifice pipette tips | Equipment | Sigma-Aldrich | P6800 | |
| Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| 254 nm germicidal UV light source | Equipment | Built into most biological safety cabinets |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).
- Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A.
- Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C.
- Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks. Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).
- Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels. Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).
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- Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels. Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).
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