Summary
이 동영상 기사에서 우리는의 분리 및 정제를위한 방법을 제시
Abstract
Protocol
Drosophila 주변의 뉴런의 마그네틱 비드 정렬에 대한 일반 댓글 (의정서의 완료에 대한 총 타이밍 : 2.5-3 시간)
깨끗하고 RNAse 무료로 환경을 유지하기위한 표준 실험실 절차 RNA 저하를 방지하기 위해 항상 준수해야합니다.
Drosophila 애벌레의 표피가 해부 및 세포 분리 버퍼에 배치되면, 주변 신경은 표피에서 분리 마지막 셀 중 하나입니다. 우리는이 속성을 악용 등 근육 사전 검사의 뉴런을 분리하기 위해 지방으로 표피의 불특정 세포의 대부분을 제거하는이 프로토콜을 설계했습니다.
연습, 전체 프로토콜은 성공적으로 약 2.5 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 실험이 시작되기 전에 항체 코팅 구슬의 준비는 완료해야합니다.
1. 바인딩 전지 자기 비즈 준비 :
이 단계는 이전 실험의 시작을 완료해야합니다. 준비 구슬이 필요 ° C까지 4 준비하고 저장할 수 있습니다.
- 신선한 PBS 500 μl에 resuspending하고 강력한 자장의 각 시간을 pelleting하여 Dynabeads M - 280 Streptavidin 코팅 구슬 PBS로 세 번 100 μl 씻으십시오.
- 마지막 undiluted biotinylated 쥐 방지 마우스 CD8a 항체 (항체 농도가 100 μg / ML)을 100 μl에서 직접 구슬을 resuspend.
- 침전을 방지하기 위해 가끔 약한 vortexing 얼음 1 시간 동안 혼합물을 품어. [Dynabeads M - 280 1 μl는 biotinylated 항체의 0.05-0.10 μg을 바인딩할 수 있습니다].
- 비드 - 항체 혼합물에게 같은 여분의 항체를 제거하는 단계 1.1에서 설명한 세 번 씻으십시오. 자석 구슬은 지금 항체로 코팅하여 사용 준비가 된 것입니다. 4 1X PBS 100 μl의 비드 - 항체 혼합물을 저장 ° C를 사용까지.
2. (10-15분) : 애벌레를 선택하고 워싱
- 30-50 세 일치 셋째 instar의 애벌레를 선택하고 1X 인산의 1-1.2 ML과 1.6ml microfuge 튜브에서 그들을 장소 살린 (PBS)를 버퍼. (3~5분)
- 각 일초에 대한 관 및 최대 설정에 소용돌이를 세 번 닫습니다.
- 불타는 광택 파스퇴르 피펫을 사용하면 완전히 뜨는 폐기하십시오. 세차 (2.1)을 반복하고 뜨는 어떤 음식 입자와 파편의 가시 명확 때까지 와동 (2.2) 3-4 회 단계를 반복합니다.
- 간단히 70 % 에탄올 1 ML로 세척을 반복하고 뜨는 폐기하십시오.
- ddH2O 1 ML과 함께 두 번 애벌레를 세척하고 뜨는 폐기하십시오.
- 간단히 RNase - 어웨이 1 ML과 함께 다시 한번 세척을 반복하고 뜨는 폐기하십시오.
- RNase 작별의 완전한 제거를 위해 ddH2O 1 ML에있는 애벌레 세 번 씻으십시오.
3. 해부 : (10-12분)
- Sylgard 코팅 35mm 페트리 접시의 중앙에 자리 10-12 애벌레. 조금씩 서로 떨어져 그들을 놓습니다. [중요 단계 : 적절한 발달 단계에되지 않는 것 같습니다 어떤 애벌레를 삭제]
- 모든 애벌레에 대한 미세 해부 가위의 쌍을 사용하여 애벌레의 앞쪽에 팁을 오픈 했네요.
- 애벌레 내부 아웃 반전 재미 더몬트 제 5 포셉 한 켤레를 사용합니다. 애벌레 표피 안쪽 뒷부분 끝까지 하나 forcep를 삽입합니다. 표피 (그림 1A) (쉽게 만들기 위해 Sylgard 표면에 표피를 눌러보십시오)의 뒷부분 끝을 잡고 함께 포셉의 팁을 핀치. 포셉의 두 번째 쌍을 사용하여 밖으로 내부의 애벌레 표피 밀어. [중요 단계 : 세포 분리 실험을 시도하기 전에이 방법을 몇 번 연습하십시오. 모든 부드러운 조직이 쉽게 분리를위한 솔루션에 노출되는 것을 보장하기 위해, 완전히 거꾸로 애벌레를보십시오.]
- 3-4 유충을 해부하면, 1.6 ML의 microfuge 관에 신선하고 차가운 PBS (얼음 튜브를 삽입)로 즉시 전송합니다.
- 필요한 모든 애벌레가 (이 프로토콜 30-40 애벌레) 수집되기 전까지는 3.4 단계 3.1 반복합니다. [중요 단계 :. 10~20%의 해부와 분리하는 동안 손실과 계획을 예측 따라]
4. 느슨하게 자기편 아닌 특정 세포의 제거 : (2-3 분)
[이 단계는 지방 기관 및 CNS로 느슨하게 자기편 아닌 특정 조직의 비운을 에이즈.]
- 거꾸로 애벌레 발톱 뿌리의 엷은 피부를 포함하는 1.6 ML의 microfuge 튜브를 타고 신선한 얼음처럼 차가운 PBS의 약 700-800 μl로 뜨는 교체하십시오.
- 펄스 - 와동 microfuge 튜브 최고 속도에서 5 회 (펄스 당 3 초).
- 뜨는을 취소하고 약 700-800 μl 신선하고 차가운 PBS로 바꾸십시오.
- 단계 4.2 4.3 세 번 반복합니다.
- 레스신선하고 차가운 PBS 400 μl의 애벌레 손톱을 uspend
5. 단일 세포 현탁액에 조직을 Dissociating (18~20분)
[중요 단계 : 이상 - 해리는 가난한 세포 수율과 낮은 세포 생존에 선도적인 세포 표면 마커의 손실이 발생할 수 있습니다. 애벌레 조직도 기계적 해리 (sonication, douncing), 효소 분해 (트립신, collagenase 등) 또는이 둘의 조합으로 dissociated 수 있습니다. 이 애벌레 조직이 분열시키다하기가 어렵습니다, 우리는 모두 기계 및 효소 분해의 조합은 최상의 결과를 굴복 것으로 나타났습니다.]
- PBS 400 μl의 중단 애벌레 표피에 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch 단위 / 유리병) 1.5 μl를 추가합니다.
- 최대 설정 (이것은 솔루션에 표피에서 느슨하게 자기편 세포를 제거한다) 각 일초에 대한 소용돌이 솔루션에게 2-3 번.
- 5 분 실내 온도 (22-25 ° C)에서 솔루션을 품어. [중요 단계 : 부화 시간이 크게 최종 셀 정렬의 효율성에 영향을 미칩니다. 권장 부화 시간은 조직을 느슨해진 충분한해야합니다. 15 분 초과하지 마십시오.]
- 펄스 - 와동 튜브 전속력으로 펄스 당 2 초 최대 설정에서 20-30 시간. 이것은 솔루션에 근육과 다른 조직을 출시한다. 각 단계에서 스테레오 현미경 형광 아래의 솔루션의 작은 샘플을 검사합니다. (경험을 가진 사람이 직접 형광 활성화된 스테레오 현미경 microfuge 관을 관찰하여 분리 수준을 확인할 수 있어야합니다)
- 신선하고 차가운 PBS로 애벌레의 발톱 뿌리의 엷은 피부에게 2-3 번 씻고 마지막 신선한 얼음처럼 차가운 PBS가 포함된 1 % BSA 500 μl 그들을 resuspend.
- 2 ML의 Kontes 조직 분쇄기, 대형 통관 유봉, 사전 코트 조직 분쇄기 및 PBS 용액에 1 % BSA와 BSA의 솔루션을 폐기 린스 간단한 이후 유봉의 유리 표면에 고집 애벌레 표피를 피하려면. 그 후, 불을 광택 파스퇴르 피펫 사용하여 BSA - 코팅 조직 분쇄기 단계로 5.5에서 손톱을 전송. [중요 단계 : 세포 손상 / 용해를 방지하기 위해 몇 분 동안 얼음에 배치하여 사전 멋진 조직 분쇄기 / 유봉].
- (약 20-30 치기) 얼굴이 볼만을 피하고, 천천히 그리고 계속해서 함께 조직을 다운스. [중요 단계 :. 천천히 그리고 꾸준히 다운스, 그렇지 않으면 세포가 lyse 수 있습니다]
- 세포 분리 수준을 평가하기 위해, 깨끗한 Kimwipe 조직과 조직 분쇄기의 외벽을 닦아, 그리고 스테레오 현미경 형광 하에서 그것을 검사합니다. 뉴런은 표피에서 분리해야하고, 솔루션에 볼 수 있습니다. 이것이 어려운 것으로 판명될 경우, 또는 솔루션의 작은 샘플을 피펫, 그리고 스테레오 현미경 형광 하에서 그것을 관찰합니다. 세포 분리의 좋은 표시는 애벌레 표피에서 뉴런의 부재입니다. 하나는 아직 표피에 연결된 뉴런을 관찰하거나, 불완전하게 dissociated 세포를 관찰하면 세포가 하나의 세포 현탁액을 달성 때까지 그러나, 더 다운스.
- 불타는 광택 파스퇴르 피펫으로 용액, 5 번 씹다가 불을 광택 파스퇴르 피펫 10 배 표준 팁 직경의 약 25 % 줄여주 다음, 표준 팁 직경의 약 50 % 좁게. [중요 단계 : 강력 분쇄는 세포가 손상될 수 있습니다. 단계 사이의 세포를 모니터하고 그에 따라 절차를 조정].
- 30 μm의 셀 필터를 통해 솔루션을 필터와 1.6 ML의 microfuge 튜브에 세포 여과물를 수집합니다. 그 결과 솔루션은 단일 세포 현탁액으로 이루어져 지금은 자기 세포 분류를위한 준비해야합니다.
6. 마그네틱 비드 셀 정렬 (45-75분, 항체 배양 시간에 따라 다름)
- 세포 현탁액 500 μl (5.10 단계)에 항체 코팅 자기 구슬 15 μl를 추가합니다. 이후 셀 isolations에 필요한 때까지 나머지 항체 복합 자석 구슬을 저장할 수 있습니다.
- 가끔 손으로 믹싱과 얼음 30-60분에 대한 항체 코팅 자석 구슬로 세포를 품어. [중요 단계 : 부화 높은 온도 또는 긴 시간에서가 아닌 특정 항체 바인딩이 발생할 수 있습니다.]
- 이분의 강력한 자장에 microfuge 튜브를 놓습니다. 언바운드 비즈와 함께 모든 긍정적으로 선택한 세포는 튜브의 측면으로 구분됩니다.
- 천천히 세포 펠렛을 방해하지 않도록하고, 표면에 뜨는를 피펫.
- 남아있는 불특정 세포를 제거하는 신선하고 차가운 PBS에 세포에게 3-4 회 씻으십시오.
- 신선하고 차가운 PBS의 30 μl의 세포를 Resuspend.
- 대략 순결과 세포의 항복하려면 셀 susp의 피펫 5 μlhemocytometer의 광택 표면에 ension 및 스테레오 - 현미경 형광의 모든 보이는 형광 세포를 계산합니다. 또한 비 형광 세포와 불순물의 흔적 금액을 확인합니다. 일반적으로 샘플은 높은 형광 세포에 대한 풍부합니다.
7. 마그네틱 비드 정렬 세포로부터 RNA 분리 : (60-75분)
- , 펠렛에게 자기 분야에서 세포를 계산 후, 표면에 뜨는를 버리고 PicoPure ™ RNA 격리 키트 (분자 장치)에서 추출 버퍼 20 μl를 추가합니다. 휴대폰 번호에 따라 하나 추출 버퍼의 높은 볼륨을 추가해야 할 수도 있습니다.
- 소용돌이 최대 속도에서 튜브 추출 버퍼와 세포 펠렛의 혼합을 사용합니다.
- 30 분 42 ° C에서 튜브를 품어.
- 이전 RNA의 열 정화 (단계 7.5 참조) 자기 구슬의 제거를 보장하기 위해 튜브를 간단히 펠렛 2 분 자성 비즈 2,000 (X) g에 centrifuged입니다. 튜브는 다음 펠렛을 유지하는 강한 자장에 배치하고, 뜨는은 새로운 microfuge 튜브로 전송됩니다.
- 추출 및 열 PicoPure RNA 추출 키트 제조 업체의 지침에 따라 RNA 정화. DNAse 치료는 선택 사항이며, 분석 요구에 따라 RNA 정화 동안 열을 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 사용을위한 준비까지 -80에서 용출 버퍼와 저장 ° C의 작은 볼륨 (11-30 μl)에서 바운드 총 RNA를 elute. 원하는 경우 1 μl 나누어지는는 Bioanalyzer 2100 (애질런트 테크놀로지 주식 회사)에서 총 RNA의 품질을 평가하기 위해 사용할 수 있습니다.
대표 결과 :
마그네틱 비드 정렬은 Drosophila 다 신경을 (그림 1) 분리하기 위해 사용되었다. 이러한 절연 다의 뉴런 (그림 2A)에서 정화 RNA는 애질런트 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지 주식 회사)에서 분석하면 날카로운 5.8S, 18S 및 28S ribosomal RNA의 봉우리의 존재로 표시로서 우수한 품질의 것을 알았습니다 ( 그림 2B). 30-40 셋째 instar의 애벌레부터 우리는을 사용하여 평균 PPK - GAL4 드라이버를 사용하여 300-500 클래스 IV DA의 뉴런과 뉴런의 1500년에서 2000년까지 DA (클래스 I, II, III 및 IV)에 분리 수 있었다 냄비를 DA 뉴런 특정 GAL4 21-7 드라이버. 우리 고립된 세포의 연결을 특정 농축을 평가하기 위해 두 가지의 연결을 유전자 특정 마커를 (elav 및 futsch)을 사용하여 정량 반대 전사 PCR (qRT - PCR)을 수행. 이러한 분석은 우리의 프로토콜 (그림 3)를 사용을 통해 흐름에 비해 검찰의 뉴런에 매우 구체적인 농축을 나타내는 마커 유전자 모두의 중요한 배 농축을 공개했다. 마지막으로, 팬 - DA의 뉴런과 클래스 IV DA의 뉴런 모두에서 분리된 RNA는 애질런트 Drosophila melanogaster 전체 - 게놈 oligo의 microarrays (4 X 44K) (그림 4)에 transcriptional 표현 프로 파일링을 수행하는 데 사용되었다. 이러한 분석은 이전에 uncharacterized 분자 잠재적 DA 신경 세포 개발에 중요한 기능 역할을 putative 신호 전달 경로의 광범위한 스펙트럼 이외에 다 신경 세포 dendrite의 morphogenesis 수많은 이전에 연루 규제를 발견. DA 뉴런의 개발, 특히 dendrite morphogenesis을 중재에 이러한 이전 uncharacterized 분자의 잠재적인 역할 (들)을 평가하기위한 연구가 현재 진행되고 있습니다.
그림 1 :. DA 뉴런 특정 GAL4 베어링 Drosophila 검찰의 뉴런의 자성 비드 분류의 도식 (A) 연령 일치 셋째 instar의 애벌레, UAS - mCD8 - GFP 기자 transgene은 반전 애벌레 표피 안에 아웃을 폭로하여 해부 아르 분리 버퍼 PNS는 얼음처럼 차가운 PBS에 저장됩니다. (B) 효소 분리가 애벌레 표피를 포함하는 솔루션에 Liberase Blendzyme 3 추가하여 수행됩니다. (C) 애벌레 조직은 vortexing, 가루약의 조합에 의해 더 dissociated하고 douncing 같은 지방 단체, 창자 및 CNS. (D, E) 세포 다음 30 μm의 세포 필터를 사용하여 필터링됩니다 아닌 구체적으로 표시된 조직을 제거합니다. 이 솔루션은 상피 조직, 근육 및 신경을 포함한 다양한 세포 유형의 단일 세포 현탁액이 포함되어 있습니다. (F) 안티 마우스 CD8a - 항체 코팅 Dynabeads M - 280이 세포 현탁액에 추가하고, 30~60분 위해 얼음 incubated 수 있습니다. ( g) 자기 구슬이 GFP 융합 단백질. (H, I) 마그네틱 비드 코팅 세포는 강한 자장에 솔루션을 배치로 구분됩니다 태그를 마우스 CD8을 표현하는 검찰의 뉴런에 바인딩합니다. 뜨는은 무시되고 전지 (J) H의 결과, 잔여 불특정 세포를 제거하는 세 번 씻어 아르ighly 뭐냐 뉴런의 인구를 정화. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2 : 세포 분리 및 마그네틱 비드별로 정렬 절연 긍정적으로 선정, GFP 형광 클래스 IV DA의 뉴런의 (A) 대표 이미지. 뉴런의 결과로 인구가 매우 거의 또는 전혀 오염 세포 불순물이 클래스 IV DA의 뉴런에 풍부하게하는 결정되었습니다. (B) 총 RNA의 애질런트 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지 주식 회사) electropherogram 자석 비드 정렬 검찰의 뉴런으로부터 격리 같은 5.8S, 18S, 28S 및 rRNAs의 존재로 표시 뛰어난 총 RNA의 품질을 보여주는. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 3 : 격리 다 뉴런 (GAL421 - 7, UAS - mCD8 - GFP)과 분수를 통해 흐름이 세중의에서 수행된에의 연결 마커 유전자 발현의 qRT - PCR 분석. 두의 연결을 특정 마커 유전자 (elav 및 futsch)의 표현 수준은 qRT - PCR에 의해 평가되었다. 이러한 분석에서 얻은 값은 내생 컨트롤 (rp49)에 정규화되었으며, 분수를 통해 흐름 관찰들에게 상대적인 수준은 ΔΔCτ 방법 6을 사용 계산되었습니다. 분획을 통해 흐름에 비해 elav과 futsch 모두 상당히 고립 DA 뉴런의 인구 풍부하게했다.
그림 4 : microarray 이미지 파일 레이블 대표 클래스 - IV DA 뉴런 특정 Cy3. 마그네틱 비드 정렬하여 정화 클래스 IV DA의 뉴런으로부터 격리 Cy3 - labeld 총 RNA와 hybridized 애질런트 Drosophila melanogaster 전체 - 게놈 oligo microarray (4 X 44K)입니다 여기에 표시됩니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 4의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
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Discussion
여기에 제시 프로토콜은 자기 비드 셀 정렬 전략을 사용하여 Drosophila 셋째 instar 애벌레의 표피의 내부 표면에 단단히 고수 주변 뉴런의 분리 및 정제에 최적입니다. 우리가 구체적으로 애벌레 또는 개발의 pupal 단계에있는 표피에 맞게 다른 세포 유형의 고립이 프로토콜의 Drosophila 뭐냐 뉴런, 응용 프로그램을 분리하기 위해이 프로토콜을 사용하는 동안 (예 : 상피 조직, 근육, 기타 말초 신경)에 적용할 수 있습니다 세포 유형이나 관심의 종류를 분류 UAS - mCD8 - GFP의 기자 transgenes는 몇 가지 매개 변수를 변화 독특한 GAL4를 사용합니다. 또한,이 프로토콜은 관심사의 유전자가 하나 직접하는 GAL4 transgene와 결합 수있는 UAS - mCD8 - GFP의 transgene에 복제됩니다 손실의 기능과 이득의 기능의 접근법 모두에서 사용할 수있는 유전자를 구체적인 손실의 기능 (예 : UAS - RNAi) 또는 관심의 세포 유형으로 이득의 기능. 예를 들어, 전사 인자의 경우 하나는 손실 함수 또는 이득의 기능은 관심의 세포 유형의 표현에 따라 잠재적으로 위 또는 아래 - 규제 유전자를 식별하실 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해 관심의 정화 세포 유형에서 총 RNA를 분리하고 microarray 표현 프로파일을 수행하는이 RNA를 사용하여 그것은 세포 내에서 phenotypic 변화를 중재의 역할을 transcriptional 규정의 하류 목표를 나타내는 수 differentially 규제 유전자를 식별할 수 있습니다 .
성공적인 셀 정렬은 위의 프로토콜 강조 중요한 단계에 세심한주의를 제공하는 것이 필수적입니다. 세포 유형에 따라 몇 가지 추가적인 문제 해결과 최적화를 요구할 수 있습니다 일반적인 문제 영역의 예로는, (1) 낮은 세포 수율 및 자기 구슬 고립 동안 clumping (2) 세포를 포함합니다. 첫 번째 경우에는, 하나 Liberase Blendzyme 3 농도를 줄여보십시오 수 있으며, douncing를 통해 기계적 분리를 증가시켜 보상. 두 번째 경우에는, 하나는 자석을 통해 접착 연구실 테이프 하나 또는 여러 개의 레이어를 적용하여 자기장 강도를 줄여보십시오 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 DRS 감사합니다. Yuh - Nung 본 연구에 사용된 비행 주식을 제공하고 월 웨스 Grueber. 저자 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 기념이 연구의 지원 트러스트 (DNC)와 조지 메이슨 대학 프로보츠 사무소 (EPRI)을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche Group | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | |
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GIBCO, by Life Technologies | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
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References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
