Summary
Das Küken Chorioallantoismembran (CAM) ist eine einzigartige, natürlich immundefizienten unterstützende Kultur Umwelt, die Angiogenese und Tumorentstehung zu untersuchen. Dieses Video Artikel zeigt die verschiedenen Schritte in chick
Abstract
Hühnereier in der frühen Phase der Zucht sind zwischen in vitro und in vivo-Systeme und eine vaskuläre Testumgebung nicht nur die Angiogenese zu studieren, sondern auch zu Tumorgenese zu studieren. Nach dem chick Chorioallantoismembran (CAM) entwickelt hat, kann seine Blutgefäß-Netz leicht zugänglich, manipuliert und beobachtet und bietet somit eine optimale Einstellung für die Angiogenese-Assays. Da das Lymphsystem ist nicht vollständig bis in den späten Stadien der Inkubationszeit entwickelt, dient der Hühnerembryo als natürlich immundefizienten Host in der Lage ist, ein dauerhaftes veredelt Gewebe und Zellen ohne artspezifische Einschränkungen. Neben der Pflege der Entwicklung allo-und Xenotransplantate, bietet die CAM Blutgefäß-Netz ein einzigartiges Umfeld für Tumorzellen intravasation, Verbreitung und vaskuläre Verhaftung und ein Repository, in dem arretierten Zellen extravasieren zu Mikro Metastasenherde bilden.
Für experimentelle Zwecke in den meisten der jüngsten Studien der CAM wurde, indem ein Fenster, durch die Eierschale und Experimente wurden in ovo durchgeführt, was zu erheblichen Einschränkungen in der Erreichbarkeit der CAM und Möglichkeiten für die Beobachtung und Fotodokumentation von Einflüssen ausgesetzt. Wenn Shell-less Kulturen der Hühnerembryo 1-4 wurden verwendet, keine experimentellen Angaben gemacht wurden und, wenn überhaupt veröffentlicht wurde, waren die Überlebensraten von diesen Kulturen gering. Wir verfeinerten die Methode der ex ovo Kultur der Hühnerembryonen signifikant durch die Einführung einer rational gesteuerten Extrusion der Ei Inhalte. Diese ex ovo Kulturen verbessern die Erreichbarkeit der CAM-und Hühnerembryonen, so dass in vivo Dokumentation der Effekte einfach und erleichtert experimentelle Manipulation des Embryos. Dies ermöglicht den erfolgreichen Einsatz einer großen Anzahl von wissenschaftlichen Fragestellungen: (1) Als eine verbesserte Angiogenese-Assay 5,6, (2) einen experimentellen Aufbau für einen erleichterten Injektionen in den Glaskörper des Hühnerembryo Auge 7-9 eingestellt, (3) als Testumgebung für die Verbreitung und intravasation verstreuter Tumorzellen aus etablierten Zelllinien auf der CAM 10-12 geimpft, (4) eine verbesserte tragendes System für eine erfolgreiche Transplantation und Kultur der Gliedmaßen von Hühnern und Mäusen 13 sowie (5 ) für die Transplantation, die Ausbreitung und Re-Transplantation von soliden primären Tumorgewebe von Biopsien auf der Oberfläche der CAM 14 erhalten.
In diesem Video-Artikel beschreiben wir die Einrichtung eines raffinierten chick ex ovo Kultur und CAM-Assay mit Überlebensraten von über 50%. Außerdem haben wir eine Schritt für Schritt Demonstration der erfolgreichen Anwendung der ex ovo Kultur für eine große Anzahl von wissenschaftlichen Anwendungen.
Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, und Sebastian Gustmann trugen gleichermaßen zu dieser Studie.
Protocol
Alle Geräte und Reagenzien sind gekauft sterile oder muss Wärme oder Dampf sterilisiert oder sterilisiert mit 70% EtOH werden.
Die Autoren stellen fest, dass Tierversuche in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie (86/609/EWG) durchgeführt wurden, nach den Richtlinien der NIH zur Pflege und Verwendung von Tieren für experimentelle Verfahren und den Regularien der Institutional Tiere gesetzt Pflege und Nutzung Committee (IACUC) an der Universität Duisburg-Essen (Deutschland).
Teil 1: Die Inkubation von Eiern
- Befruchteten Eier können bei 13 ° C gelagert werden bis zu einer Woche.
- Die Eier werden für 72 Stunden inkubiert, liegend in einem Inkubator mit einer bewegten Fach, Drehen der Eier 12 Mal am Tag kontinuierlich. Die Luftfeuchtigkeit ist bei 60 - 62%, Inkubationstemperatur auf 37,5 ° C.
Hinweis: Vor Beginn der Inkubation, Schmutz, Federn und Kot werden sorgfältig von den Eierschalen mechanisch durch trockenes Abwischen mit gemeinsamen, grau Zick-Zack-Papierhandtücher, die eine rauhe, anstatt eine weiche Oberflächenstruktur entfernt wurden. Wischen Sie die Eier mit Ethanol oder Desinfektionsmittel, jedoch deutlich Überlebensrate der Embryonen, unabhängig von der verwendeten Flüssigkeit reduziert.
Teil 2: Ex ovo Kultur
- Nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden werden die Eier aus dem Brutschrank entnommen.
Hinweis: Die Eier werden für 72 Stunden inkubiert, weil - nach unserer Experimente - aus unbekannten Gründen, sondern im Einvernehmen mit Auerbach et al.1 früheren Entwicklungsstadien hatten signifikant niedrigere Überlebensraten. In Etappen später als 72 Stunden die Dottersack, die noch nicht von der CAM abgedeckt wird dünner und neigt dazu, auf die Eierschale führenden (i) zu kleinen Blutungen in den Bereich der Haftung und (ii) den Bruch der Dottersack haften Membran. Daher ist die vorgestellte Methode ist nicht anwendbar auf Embryonen älter als 72 Stunden. - Die Oberseite der Eier, in denen der Embryo lebt, ist mit Bleistift markiert, da der Embryo widersteht Rotation zu einem gewissen Grad.
- Das Ei ist horizontal mit dem Bleistift auf der Oberseite gehalten und rissig am Rande einer 80 mm dreieckige Rührfisch Verlegung senkrecht zur Längsachse des Eies.
Hinweis: Für ein besseres Gefühl, keine Handschuhe sollten benutzt werden, aber die Hände sind mit 70% EtOH desinfiziert werden. Es ist wichtig, dass die Eierschale sowie die Eihülle geöffnet sind. Undichte von Eiweiß ist ein sicheres Zeichen dafür, dass die Eihülle perforiert wurde. - Das Ei liegt in der Nähe der Unterseite der Petrischale zur weiteren Austritt von Eiweiß zu vermeiden gehalten.
Hinweis: Während der ersten Öffnungsvorgang, ist es wichtig, dass das Eiweiß auf der Unterseite der Petrischale noch den Rest im Ei, da dies Ergebnisse verbunden in einem Vakuum im Inneren des Eies, die das Eigelb hält mit dem Embryo auf Innenseite das Ei. Das Vakuum kann entweder durch Fingerdruck die den Einlass von Luft steuert in die Eizelle oder durch Anheben des Eies, die die Spalte verbunden Eiweiß dh bei wachsendem Unterdruck geregelt werden. - Durch sanftes Druck auf die Meridiane, die durch den Riss und Äquator des Eies mit dem Daumen und Mittelfinger ist es möglich, das Vakuum zu regulieren. Der Inhalt des Eies kann dann auf die Petrischale unbeschädigt übertragen werden, wenn das Ei mit dem Eigelb vorsichtig angehoben und die beiden Hälften der Schale werden sorgfältig getrennt. Der Embryo und das Eigelb Schiffe sollten nicht auf eine unbeschädigte Dotter liegen.
Hinweis: Wenn der Bleistift ist nicht an der Spitze gehalten, der Embryo kann weh tun, wenn Knacken der Schale sein. Wenn die Eier nicht sorgfältig genug oder rissige die Embryonen sind älter als 72 Stunden (siehe oben), steckt den Dottersack mit der Schale und oft reißt. Das gleiche passiert, wenn die Feuchtigkeit des Inkubators ist niedriger als 60% oder Eier sind nicht gedreht während der Inkubation. - Ex ovo Kulturen in einen Inkubator zurück und hielt bei 37,5 ° 38,2 ° C und 60% Luftfeuchtigkeit. CO 2 oder O 2-Versorgung ist nicht erforderlich, wenn der Inkubator ist nicht hermetisch (Lüftungsgitter teilweise geöffnet!) Geschlossen und spezielle Petrischalen mit Abstandshalter zwischen Deckel und Schüssel verwendet werden.
Hinweis: Das Verschieben der Embryonen sollten auf ein Minimum in den ersten Tagen der Inkubation gehalten werden. Zu viel Aufregung führt zu einer hohen Sterblichkeitsrate. Von Inkubation Tag 9 ab, werden die Embryonen weniger empfindlich auf Bewegung.
Tote Embryonen sollten sofort entfernt werden, um Infektionen zu vermeiden.
Wenn Zellkultur-Inkubatoren verwendet werden, die sind luftdicht verschlossen, O 2-Versorgung ist für die Embryonen nicht zu sterben. Feuchtigkeit ist essentiell für die CAM nicht austrocknen und wenn Inkubationstemperatur ist niedriger als 37 ° C, die Embryonen zu langsam entwickeln.
Teil 3: Anwendung von Stoffen für die Angiogenese Assays
- Autoklaviert Faltenfilter (5.5 Mm im Durchmesser) werden durch einen Locher gestanzt und als Trägermaterial (Träger) für flüssige Stoffe angewendet, um die CAM.
Hinweis: Fast jedes Trägermaterial (siehe Tabelle unten) verursacht Reizungen der CAM, insbesondere dann, wenn vor der Inkubation Tag 10 angewendet, da es die Entwicklung von CAM Schiff Architektur verändert. Dies möglicherweise auch inerte Stoffe wie Hydroxyethylcellulose Folie enthalten, Teflon Schwämme (PTFE-Tupfer), Kollagenschwämmen Kollagenfolie, sterile Gaze (Tupfer), runde Deckgläser und Silizium-Ringe, die alle verursacht falsch-positive Ergebnisse. Filterpapier schien am wenigsten zu Reizungen führen und wurde daher in unseren Tests verwendet. - Wenn das CAM voll entwickelt ist, kann bis zu 6 verschiedene Proben angewendet werden und deren Auswirkungen können auf einem einzigen CAM verglichen werden.
- Um zu vermeiden, Trockenfilter zusätzliche Dosen (3 ug nativen Angiotropin) oder Puffer (5 ul PBS) sollte erneut angewendet werden jeden Tag.
- Ab dem 3. Tag nach der Applikation orientieren Blutgefäße in Richtung des angiogenen Substanzen auf die Filter, während das Muster der Blutgefäße umgebenden steuert, ist unverändert.
Hinweis: Die CAM sollte nicht für den Dottersack verwechselt werden. Die CAM ist eine dynamische Entwicklung Struktur, während der Dottersack ist statisch mit wenig Abweichungen während der Entwicklung. Am dritten Tag der Entwicklung der Entwicklungsländer CAM kann zum ersten Mal am kaudalen Ende des Embryos werden als kleine Blase erkannt. Zwischen Tag drei und Tag zehn der ersten Blase dehnt sich aus, die Schaffung eines gefalteten zweischichtige Membran überwuchern den Dottersack mit zunehmender Geschwindigkeit. Die Applikationsstelle sollte auf halbem Weg zwischen Embryo und der Falte des CAM (Grenze), da sonst der Embryo behindert mikroskopische Beobachtung der Effekte im Durchlicht werden. Alternativ wird der Filter mit der angiogenen Substanz verinnerlicht, wenn die CAM wächst.
Teil 4: Inokulation von Zellen auf der CAM
4.1.Preparation von Zellen
- Konfluenten Zellen werden aus Kulturflasche zu Falcon-Röhrchen durch die Verwendung einer sterilen 25 ml Plastikpipette mit einer Pipette Hilfe übertragen.
- Zur Abschätzung der Zellzahl ist 15 ul der Zellsuspension zu einer Neubauer Kammer übertragen und die Zellen werden manuell unter einem Mikroskop ausgezählt.
- Falcon Röhrchen für 3 min bei 1000 rpm bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand wird verworfen.
- Für Live-Cell-Tracking werden die Zellen mit PBS auf die gewünschte Konzentration (hier: 2x10 7 Zellen / ml) verdünnt und gefärbt mit zB PKH26 (Sigma), ein rot fluoreszierendes leben Zellmembran Labeling Kit, je nach Hersteller-Protokoll.
Auf die gewünschte Konzentration zur Injektion (10 7 Zellen / ml) oder Impfung (3x10 6 Zellen / ml); Die Zellen werden in Zellkulturmedium (DMEM bevorzugt Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium) resuspendiert. Verschiedene Zell-Konzentrationen sind für Injektionen vs Impfung nach Konzentrationen bereits in der Literatur 15-17 und unsere Erfahrung veröffentlichte angewendet.
4,2 Inokulation von Zellen auf der CAM
- Ringe (~ 1 mm Dicke) werden aus einer 1 ml Pipette oder einer peripheren Venenkatheter (PVL) Rohr durch die Verwendung eines scharfen Skalpell ausgeschnitten und auf die CAM ein E6-E14 Hühnerembryonen gezüchtet ex ovo.
Hinweis: Versuchen Sie nicht, "sah" mehrere Male, aber durch die Pipettenspitze oder Katheterschlauch mit einem Schnitt Schnitt mit einem neuen, sehr scharfes Skalpell, um scharfe Kanten an den entstandenen Ringe zu vermeiden. Überprüfen Sie die Ringe unter dem Mikroskop auf scharfe Kanten, die aus Mikro-Risse. - Abhängig von der Größe der Ringe 20 ul von 3x10 6 Zellen / ml Zellen werden in insgesamt in einem Ring oder als Split-Bände in mehrere Ringe pipettiert.
Hinweis: In einigen Fällen Traumatisierung des CAM durch vorsichtiges Schaben ist eine Voraussetzung, um zB Inokulation von Zellen 17 und Kapillarisation von Transplantaten (siehe unten) zu erleichtern. Wenn jedoch Traumatisierung der CAM nicht beabsichtigt ist oder kontraindikativ, zB für Studien über das invasive Potential von Tumorzellen, Ringe dürfen nicht zur Impfung verwendet werden, sondern Zellen sollten direkt als Anwendung oder Ringe angewendet werden selbst veranlassen könnte micro Läsion . Wenn Ringe verwendet werden, sollten diese geschnitten so dünn wie möglich, um Gewicht zu minimieren und zu vermeiden Einzug der CAM werden.
Teil 5: intravitrealen Injektion von Zellen
- Ein Hamilton Mikroliterspritze wird mehrmals mit 70% EtOH und schließlich mit sterilem PBS gespült.
- Die Mikro-Spritze wird mit der vorbereiteten gefärbt oder ungefärbt Zellsuspension (siehe Teil 4.1) gefüllt.
Hinweis: Die Injektionsstelle muss sorgfältig ausgewählt werden, um nicht zu Blutgefäße der CAM oder benachbarten Strukturen des Embryos (brain!) durch Verletzungen über das Eindringen der Nadel. Die Injektion sollte unter einem Binokular dissection durchgeführt werden. - Unter dem Mikroskop kontrollierenSorgfältig, aber schnell durchdringen die CAM und Auge Schichten mit der Injektionsnadel und kontinuierlich injizieren 10 bis maximal 20 ul Zellsuspension (vorzugsweise in PBS verdünnt) in den Glaskörper des Hühnerembryo gezüchtet ex ovo.
Hinweis: Wenn das CAM kann nicht mit der Nadel durchstochen werden, könnte es an einem Standort mit wenigen oder keinen Blutgefäße durch leichtes Abreißen mit zwei Pinzetten entfernt werden. - Die Nadel sollte 1-2 Sekunden bleiben in das Auge zu einem Verlust der injizierten Zellsuspension durch ein Auslaufen zu vermeiden.
Teil 6: Präparation Huhn Gliedmaßenknospen
- Die Eier werden aus dem Brutschrank entnommen, nachdem 3 bis 4 Tagen Inkubation (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23)
- Die Eier werden auf dem Rand eines dreieckigen Rührfisch geknackt und in eine Petrischale (Details: siehe Teil 2) und der Embryo ist von den angeschlossenen Eigelb Schiffe, indem ein Kreis mit Feder Schere durchtrennt.
- Der Embryo wird in ein frisches Petrischale mit kaltem, sterilem PBS mit Hilfe eines kleinen drain Löffel gefüllt übertragen und gewaschen mit freundlicher Agitation.
- Der Embryo wird zu einer kleinen Petrischale mit sterilem PBS gefüllt und frei von umgebenden Membranen übertragen, sorgfältig reißen sie auseinander mit feinen Pinzetten.
- Extremitätenknospen werden durch mikrochirurgische Pinzette so nah wie möglich am Körper losgelöst, ergriff und an die CAM einer 8-10 Tage alten Host-Huhn gezüchtet ex ovo (siehe Pfropfen-Verfahren).
Teil 7: Vorbereitung der Maus Gliedmaßenknospen
- Zeit schwanger Paarungen aufgestellt und am Morgen des Tages, an dem ein Vaginalpfropf bei Frauen Paarung erkannt wird, ist Schwangerschaftswoche Tag 0 bezeichnet.
- Die schwangere Frau ist durch Genickbruch, wenn die Entwicklung der Embryonen embryonale Tag erreicht (E) 10 bis 13 und auf einer Wachs-board geopfert.
- Die Bauchdecke wird mit 70% EtOH angefeuchtet, geschnitten entlang der Mittellinie und die Hautlappen werden seitlich durch Stifte befestigt.
- Beide Hörner des Uterus aus dem Bauch, gelöst und in ein Becherglas mit kaltem PBS entfernt.
- Die Embryonen werden getrennt, in eine Petrischale und Gebärmutterwand und embryonalen Membranen sind sorgfältig durch die Nutzung einer Pinzette entfernt.
- Extremitätenknospen werden durch Einsatz von Feder Schere oder losgelöst von feinen Pinzette so nah wie möglich am Körper, ergriff und an die CAM von 8-10 Tage alten Host-Huhn gezüchtet ex ovo (siehe Pfropfen-Verfahren).
Teil 8: Sammlung von Tumorproben
- Tumor-Biopsien werden in 2 ml Eppendorf-Röhrchen mit Tumor-Zell-spezifische Kulturmedium gefüllt (hier: Leibovitz-Medium) gesammelt und bei Raumtemperatur gehalten.
- Tumor-Biopsien sind in 1-2 mm3 Stücke von sterilen Skalpellen geschnitten.
Hinweis: Wenn Tumorproben waren zu klein, sie könnten nicht an die CAM anschließen, wenn sie zu groß waren, die CAM könnte sich verletzen und der Embryo sterben könnte. - Ein Stück aus dem Kern der Biopsie-Probe wird auf die CAM von gepfropften 8-10 Tage alten Host-Huhn gezüchtet ex ovo (siehe Pfropfen-Verfahren).
Hinweis: Unter Material von der Oberfläche der Biopsie erhöht das Risiko einer Kontamination mit Muskel-oder Bindegewebe.
Teil 9: Grafting Verfahren
- Für die Transplantation von Gliedmaßen oder Tumorproben, die voll entwickelten CAM von 8-10 Tage alten Hühnerembryonen gezüchtet ex ovo verwendet wird.
- Die Transplantate sind ideal auf die CAM in der Nähe eines Y Gabelung eines Blutgefäßes platziert.
- Bei der gewünschten Einsatzort, ist der CAM selektiv durch vorsichtiges Abkratzen (Zange) der oberen peridermal Teil des doppelten Epithelschicht traumatisiert, so dass der basalen Schicht intakt.
Hinweis: Es ist wichtig, Blutungen oder sichtbaren Bruch der Kapillaren zu vermeiden. - Das Transplantat wird auf die CAM mit minimalem PBS befestigt übertragen. Abhängig von der Graft, könnte es ein-oder zweimal auf einer Website des CAM, wenn keine endgültigen Pfropfen sollen übermäßige PBS entfernen und dann schließlich in die vorbereitete traumatisiert CAM Ort veredelt platziert werden.
- Das Transplantat wird durch feine Pinzette gefasst und geschichtet auf die CAM. Je nach Empfindlichkeit des Transplantats, könnte leichtem Druck (nicht geeignet für Gliedmaßenknospen) zu manövrieren das Transplantat in eine resultierende Einzug der CAM (geeignet für die Tumor-Proben).
Hinweis: Da die Küken Immunsystem entwickelt sich embryonalen Tag (E) 18, ex ovo Xenotransplantate Kulturen sollten nicht über E17 verlängert werden, wie die Host-Hühnerembryonen häufig sterben.
Es ist wichtig, zur Verfügung Host CAMs bzw. Hühnerembryonen gezüchtet ex ovo, zeitgleich mit einer Quelle von Spendergewebe Ihrer Wahl zusammen zu haben.
Teil 10: Re-Transplantation
- Der Gastgeber Hühnerembryo ist durch Enthauptung getötet.
- Das CAM mitder beigefügten Transplantat wird durch einen kreisförmigen Schnitt mit spitzen Schere entfernt und in einer Petrischale mit PBS gefüllt.
- Übermäßige CAM ist aus dem Transplantat im Frühjahr Schere mit Ausnahme der ehemaligen Anheftungsstelle geschnitten.
- Bei größeren Tumorproben, wird das Transplantat in Hälften oder mehrere kleinere Stücke geschnitten und mit der Schneide nach dem neuen CAM des zweiten Host wieder aufgepfropft.
Teil 11: Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Shell-less Huhn Kultur
Huhn Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien kultiviert ex ovo in Petrischalen.
Abbildung 2. Ex ovo CAM Angiogenese-Assay
Befruchtete Hühnereier wurden horizontal bei 37 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von 60 bis 62% und knackte in Petrischalen bei embryonalen Tag 4 (E4). Die Inkubation erfolgte unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt. Bei E10 sterile Filterpapiere (5,5 mm im Durchmesser) wurden auf der Oberseite des CAM geschichtet und entweder mit 5 ul PBS oder 3 ug nativen angiotropin6 getränkt. Kapillaren zeigten offensichtliche Ausrichtung auf die Angiotropin getränkten Filterpapier bei E14.
Abbildung 3. Ex ovo Pfropfung von Gliedmaßen
Extremitätenknospen von chick (E3/E4) und Maus (E13) auf die CAM von Shell-less Huhn Kulturen gepfropft. Blutgefäße aus der CAM in die Gliedmaßen nach zwei Tagen. Die Entwicklung der Gliedmaßen fort in diesen ex ovo Kulturen Erreichen einer Zwei phalange Bühne in chick und Anzeige Reduzierung der interdigitalen Bahnen in murine Gliedmaßenknospen.
Abbildung 4. Ex ovo Impfung Tumorprobe
Eine Biopsie-Probe von Blasenkarzinom wurde auf die CAM von einem 10-Tage alten Hühnerembryonen gezüchtet ex ovo geimpft. Nach zwei Tagen in Kultur wurde die Tumor-Probe in die CAM Gefäßsystem angeschlossen und nach 7 Tagen, mehrere Blutgefäße in das Transplantat beobachtet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innovative oder nur ein weiteres Küken Kultur-Protokoll?
Mit dem ehemaligen Shell-less Kultur Protokolle 1-4 Die gesamte Überlebensrate der Hühnerembryonen waren niedrig, zB ca. 30% 1. Die raffinierte ex ovo Kultur-Protokoll in diesem Video Artikel beschrieben, hingegen ermöglicht die Überlebensraten über 50%. Im Vergleich zu klassischen in-ovo-Kulturen ex ovo Kultur der Hühnerembryonen erleichtert erheblich die Erreichbarkeit der CAM-und Hühnerembryonen und ermöglicht deren experimentelle Manipulation und kontinuierliche Überwachung. Diese Kultur-Methode kann für eine Vielzahl von Anwendungen reichen von verbesserten Angiogenese Assays 5,6, erleichtert Injektionen in den Glaskörper des Hühnerembryo Auge 7-9, intravasation Assays 10-12 verwendet werden, verbessert Pfropfen und das Wachstum der Gliedmaßen 13 und innovative Pflege von Tumorproben 14. So trägt ex ovo Kultur ein nützliches Werkzeug in Entwicklungs-, Angiogenese-und Tumorforschung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei J. Kueper und J. Wittschier für hervorragende technische Unterstützung und Prof. Ruebben danken für die großzügige Bereitstellung Tumormaterial.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Eggs | Animal | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Mice | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Incubator Type 3000 with rotating egg tray | Tools | Siemens AG | 9503 | Maintain at 37°C with relative humidity set above 60% |
| Egg incubator BSS 160 | Tools | Grumbach, Germany | 8101 | Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60% |
| PBS | Reagent | Sigma-Aldrich | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium | Reagent | Sigma-Aldrich | D 6429 | DMEM culture medium |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Reagent | Invitrogen | 31415-029 | here: collection medium for tumor samples |
| Tumor cell -specific medium | Reagent | Sigma-Aldrich | each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin |
|
| 70% EtOH | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Magnetic stir bar, triangled 80 mm | Tool | VWR international | 442-0391 | A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell. |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors, straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Fine Iris scissors, straight | Tool | Fine Science Tools | 14094-11 | Use to cut our the CAM |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl | Tool | Hamilton Co | 80222 | Use for injection into the vitreous |
| Hamilton 33-G needle (15 mm) | Tool | Fine Science Tools | 18073-15 | Use for injection into the vitreous |
| Sterile scalpels | Tool | Use for dissecting tumor samples | ||
| Small drain spoon | Tool | Geuder | 15758 | Use to transfer of small chick embryos |
| Wax board with fixing pins | Tool | Home made | Use to fix of animals for dissection | |
| Petri dishes 60 x 15 mm | Tool | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Petri dishes 92 x 16 mm | Tool | Sarstedt Ltd | 82.1472 | |
| Sterile Petri dish 100 x 20 mm | Tool | Greiner Bio-One | 664160 | extra deep, with spacers for ventilation |
| Beaker | Tool | 300-600 ml | ||
| FALCON tubes | Tool | Falcon BD | 15 ml and 50 ml | |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 1.5 ml and 2 ml | |
| 1ml pipette tips | Tool | Use to cut plastic rings for application of substances / cells | ||
| Peripheral venous catheter (PVL) | Tool | Viggo® | Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells | |
| Pipettes and tips | Tool | Eppendorf | ||
| Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter | Tool | Schleicher Schuell | 311643 | Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper |
| PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm | Tool | santec-medical | REF 277, LOT 832/511-1 | Carrier; caused false positive results |
| Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 | Reagent | Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results | ||
| Kollidon 17 PF | Reagent | BASF | S30200 | mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results |
| Collagen Biomatrix TissuDura | Tool | Baxter Internationl Inc. | REF B2246000999999 | Carrier; caused false positive results |
| Round glass cover slips, 11 mm | Tool | Assistent Germany | 1001/0011 | Carrier; causes false positive results |
| Bovine Collagen Sponge | Tool | Wyeth Animal Health | Carrier; caused false positive results | |
| Resodont Absorbable Collagen Membrane | Tool | Resorba Woundcare Germany | LOT 280303 | Carrier; caused false positive results |
| Non-Woven Swabs | Tool | Fink Walter GmbH | REF 328132 | Carrier; caused false positive results |
References
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology. Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).
- Höckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and "tube formation" but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro. J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).
- Wissler, J. H. Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins]. Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).
- Kistler, H. B. J. r., LaVail, J. H. Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).
- Halfter, W. Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).
- Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo. Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).
- Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia. Urol. Res. 20, 237-239 (1992).
- Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane. Pathol. Oncol. Res. , (2008).
- Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model. J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).
- Hall, B. K. Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick. TCA Manual. 4 (3), 881-883 (1978).
- Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts' circulation. Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).
- McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma. Cancer Research. 37, 1003-1010 (1977).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Research. 65, 10959-10969 (2005).
- Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
