Pintinho Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM Ensaio: como ele realmente funciona
Summary
O filhote corioalantóicas membrana (CAM) é único, um ambiente de cultura naturalmente imunodeficientes apoio para estudar a angiogênese e tumorigênese. Este artigo vídeo demonstra as diferentes etapas no pinto<em> Ex ovo</emCultura>, aplicação de substâncias potencialmente angiogênicos e inoculação bem-sucedida de células tumorais e tecidos na superfície do CAM.
Abstract
Ovos de galinha na fase inicial da criação de animais estão entre in vitro e em sistemas in vivo e proporcionar um ambiente de teste vascular não só para estudar a angiogênese, mas também para estudar tumorigênese. Depois que o pintinho membrana corioalantóide (CAM) tem desenvolvido, sua rede de vasos sanguíneos podem ser facilmente acessados, manipulados e observados e, portanto, oferece um cenário ideal para ensaios de angiogênese. Como o sistema linfático não está totalmente desenvolvido até os estágios finais de incubação, o embrião de galinha serve como hospedeiro natural imunodeficientes capaz de sustentar os tecidos enxertados e células sem restrições espécie-específicos. Além de nutrir desenvolvimento allo e xenotransplantes, o CAM rede dos vasos sanguíneos fornece um ambiente único de apoio para intravasation célula tumoral, disseminação e prisão vascular e um repositório onde as células preso extravasar para formar micro focos de metástase.
Para fins experimentais, na maioria dos estudos recentes, a CAM foi exposta pelo corte de uma janela através da casca do ovo e experimentos foram realizados em ovo, resultando em limitações significativas na acessibilidade do CAM e possibilidades para a observação e documentação fotográfica de efeitos. Quando shell-less culturas do embrião de galinha foram usadas 1-4, não foram fornecidos detalhes experimentais e, se publicado em tudo, as taxas de sobrevivência dessas culturas foram baixas. Nós refinou o método de cultura ovo ex de embriões de galinha significativamente através da introdução de uma extrusão racionalmente controlada do conteúdo do ovo. Estas culturas ex ovo aumentar a acessibilidade do embrião CAM e pinto, permitindo fácil na documentação vivo de efeitos e facilitar a manipulação experimental do embrião. Isso permite que a aplicação bem sucedida de um grande número de questões científicas: (1) Como um ensaio de angiogênese melhorou 5,6, (2) um conjunto experimental para injectáveis facilitado no vítreo do embrião olho pinto 7-9, (3) como um ambiente de teste para a divulgação e intravasation dispersos de células tumorais de linhas celulares estabelecidas inoculados no CAM 10-12, (4) como um sistema melhorado manutenção para o transplante bem sucedido e cultura de brotos de membros de frango e camundongos, bem como 13 (5 ) para enxertia, propagação e re-enxerto de tecido de tumores sólidos primários obtidos de biópsias na superfície do CAM 14.
Neste artigo descrevemos o vídeo estabelecimento de uma cultura refinada pinto ex ovo e ensaio CAM com taxas de sobrevida em 50%. Além disso, fornecemos uma demonstração passo a passo da aplicação bem sucedida da cultura ex ovo para um grande número de aplicações científicas.
Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, e Sebastian Gustmann contribuíram igualmente para este estudo.
Protocol
Discussion
Inovador ou apenas um outro protocolo cultura pinto?
Protocolos com o ex-shell-less cultura 04/01 as taxas de sobrevivência total da embriões de galinha eram baixos, por exemplo, ca. 30% 1. O requintado ex protocolo cultura ovo descrito neste artigo de vídeo, por outro lado, permite taxas de sobrevivência superiores a 50%. Comparado ao clássico em culturas ovo cultura ovo ex de embriões de galinha significativamente fac…
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a J. e J. Kueper Wittschier de assistência técnica excelente e Ruebben Prof generosamente para fornecimento de material de tumor.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fertilized Eggs | Animal | Söries Trockels, Germany | ||
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Incubator Type 3000 with rotating egg tray | Tools | Siepmann GmbH Germany | 9503 | Maintain at 37°C with relative humidity set above 60% |
| Egg incubator BSS 160 | Tools | Grumbach, Germany | 8101 | Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60% |
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium | Reagent | Sigma | D 6429 | DMEM culture medium |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Reagent | Invitrogen | 31415-029 | here: collection medium for tumor samples |
| Tumor cell -specific medium | Reagent | Sigma | each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin |
|
| 70% EtOH | Reagent | Sigma | ||
| Magnetic stir bar, triangled 80 mm | Tool | VWR | 442-0391 | A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell. |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors, straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Fine Iris scissors, straight | Tool | Fine Science Tools | 14094-11 | Use to cut our the CAM |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl | Tool | Hamilton | 80222 | Use for injection into the vitreous |
| Hamilton 33-G needle (15 mm) | Tool | Fine Science Tools | 18073-15 | Use for injection into the vitreous |
| Sterile scalpels | Tool | Use for dissecting tumor samples | ||
| Small drain spoon | Tool | Geuder, Germany | 15758 | Use to transfer of small chick embryos |
| Wax board with fixing pins | Tool | Self made | Use to fix of animals for dissection | |
| Petri dishes 60 x 15 mm | Tool | Greiner | 628102 | |
| Petri dishes 92 x 16 mm | Tool | Sarstedt | 82.1472 | |
| Sterile Petri dish 100 x 20 mm | Tool | Greiner | 664160 | extra deep, with spacers for ventilation |
| Beaker | Tool | 300-600 ml | ||
| FALCON tubes | Tool | FALCON | 15 ml and 50 ml | |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 1.5 ml and 2 ml | |
| 1ml pipette tips | Tool | Use to cut plastic rings for application of substances / cells | ||
| Peripheral venous catheter (PVL) | Tool | Viggo® | Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells | |
| Pipettes and tips | Tool | Eppendorf / Abimed | ||
| Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter | Tool | Schleicher & Schuell | 311643 | Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper |
| PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm | Tool | santec-medical | REF 277, LOT 832/511-1 | Carrier; caused false positive results |
| Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 | Reagent | Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results | ||
| Kollidon 17 PF | Reagent | BASF | S30200 | mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results |
| Collagen Biomatrix TissuDura | Tool | Baxter Healthcare S.A. | REF B2246000999999 | Carrier; caused false positive results |
| Round glass cover slips, 11 mm | Tool | Assistent Germany | 1001/0011 | Carrier; causes false positive results |
| Bovine Collagen Sponge | Tool | Wyeth | Carrier; caused false positive results | |
| Resodont Absorbable Collagen Membrane | Tool | Resorba Woundcare Germany | LOT 280303 | Carrier; caused false positive results |
| Non-Woven Swabs | Tool | Fink & Walter GmbH | REF 328132 | Carrier; caused false positive results |
References
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