Genetische studies van het menselijk DNA Repair eiwitten met behulp van gist als een model-systeem

Summary

Genetische studies in gist kan worden gebruikt om de moleculaire en cellulaire functies van de menselijke genen te onderzoeken in de cellulaire DNA metabolisme. Methoden beschreven voor de genetische karakterisering van het menselijk

Abstract

Inzicht in de rol van menselijk DNA reparatie-eiwitten in genetische paden is een geweldige uitdaging voor veel onderzoekers. Genetische studies in zoogdieren systemen zijn te wijten aan het gebrek aan direct beschikbare tools, zoals gedefinieerd mutant genetische cellijnen, de regelgeving expressie-systemen, en geschikte selecteerbare merkers beperkt. Om deze moeilijkheden te omzeilen, hebben model genetische systemen in de lagere eukaryoten uitgegroeid tot een aantrekkelijke keuze voor de studie van functioneel geconserveerd DNA reparatie-eiwitten en routes. We hebben een model ontwikkeld gist systeem om de slecht gedefinieerde genetische functies van het Werner syndroom helicase-nuclease studie (

Protocol

1. Giststammen

Stammen met wild-type SGS1 top3 (WT, W303-1A, genotype, MAT een ade2-1 canl-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 TRPL-l ura3-1) [2], een sgs1 mutant (W1292-3C ; genotype MAT een SUP4-o:: ​​URA3 sgs1-25 ade2-1 CAN1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) en een sgs1 top3 mutant (W1058-11C, genotype, MAT een SUP4-o:: ​​URA3 sgs1-25 top3-2:: HIS3 ade2-1 CAN1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) werden gekenmerkt [3] en werden vriendelijk verschaft door Dr Rodney Rothstein (Columbia University).

2. Plasmide DNA constructies

De WRN gen werd gekloneerd in YEp112SpGAL volgens het schema zoals besproken.

1. Plaats-gerichte mutaties van de WRN (E84A exonuclease dood, K577M helicase dood, R834C, en K1016A) in het plasmide YEp195SpGAL-WRN [4] werden geconstrueerd met behulp mutagene primers en een standaard protocol van QuickChange II XL plaats-gerichte mutagenese kit (Stratagene) door Lofstrand Labs (Gaithersburg, MD).
2. DNA-fragmenten die coderen WRN en de bijbehorende varianten werden gel gezuiverd uit de respectieve YEp195SpGAL-WRN bouwt na dubbele knippen met Sal I en Mlu I.
3. Gel gezuiverde fragmenten werden vervolgens gekloneerd in de Sal ik Mlu I plaatsen van vector YEp112SpGAL, een 2 um multi-kopie plasmide dat een TRP1 selecteerbare merker aan YEp112SpGAL WRN of WRN varianten te bouwen onder de controle van een gal-induceerbare promoter zoals weergegeven in figuur 1 .
4. De constructen aldus verkregen werden genoemd als YEp112SpGAL-WRN, YEp112SpGAL-WRN E84A, YEp112SpGAL-WRN K577M, YEp112SpGAL-WRN K1016A, en YEp112SpGAL-WRN R834C.

3. Transformatie

Gistculturen werden gekweekt met behulp van standaard protocol en transformaties werden uitgevoerd met een Lithium Acetaat-gebaseerd protocol door Gietz et al. [5]. In het kort werden de volgende stappen uitgevoerd.

1. Culturen van de hierboven genoemde stammen werden gedurende de nacht gekweekt in 5 ml YPD (gistextract-pepton-dextrose) medium. Culturen werden reinoculated in 50 ml YPD medium en mochten tot een OD ₆₀₀ groeit van 1,0 - 1.2 werd bereikt.
2. Culturen werden geoogst, gewassen met 20 ml water, en opnieuw gesuspendeerd in 1 ml 100 mM lithium-acetaat (LiAc). De cellen werden geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 10 minuten.
3. Celpellet werd geresuspendeerd in 100 mM LiAc tot een eindvolume van 500 ul, wat genoeg is om tien transformaties te doen. 50 pi van de celsuspensie werd gealiquoteerd en cel-pellet werd verzameld door centrifugeren.
4. Naar de cel pellet werd toegevoegd in de volgende volgorde: 250 ul 50% polyethyleenglycol (PEG), 36 ul van 1 M LiAc, 25 pl van 2 mg / ml ssDNA (zalmsperma DNA), 5 ml van plasmide DNA (100 ng 1000 ng) en 50 pi water. Celpellet werd gevortexed gedurende 1 minuut.
5. Cellen werden vervolgens geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 30 minuten gevolgd door een heat shock bij 42 ° C gedurende 20 minuten.
6. Cellen werden geoogst en opnieuw gesuspendeerd in 1 ml water. Sinds het plasmide YEp112SpGAL bevat trp als een selecteerbare merker, zouden alle de gemuteerde stammen herbergen de construct worden trp bedreven. Daarom werden transformanten geselecteerd door plating de schorsing op SC (Synthetic compleet) glucose media ontbreekt Trp en het incuberen van de platen bij 30 ° C gedurende 3-4 dagen totdat de kolonies verschijnen.

4. Genetische analyse van de trage groei fenotype restauratie in WRN getransformeerd sgs1 top3 stam.

1. Streak analyse:

1. Om het effect van WRN expressie te onderzoeken op de groei van wild-type ouders (W303-1A), sgs1 of sgs1 top3 stammen, de overeenkomstige stammen met YEp112SpGAL of YEp112SpGAL-WRN zijn strepen op SC minus Trp platen bestaande uit 2% glucose ( glu) of 2% galactose (gal). Als een controle, was sgs1 top3 / YEp112SpGAL-SGS1 inbegrepen. Platen werden geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 2 dagen.
2. Voor het bepalen van het vermogen van WRN tot groei van sgs1 top3 stam van invloed zijn op een lager WRN eiwit expressie niveaus, de sgs1 top3 stam getransformeerd met YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN, of YEp112SpGAL-SGS1 was strepen op SC minus Trp platen met verschillende concentraties van gal uit zo laag als 0,005% tot zo hoog als 2%. Platen werden vervolgens geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 2 dagen.
3. Voor de beoordeling van de functionele eisen van WRN aan de trage groei fenotype te herstellen in de top3 sgs1 achtergrond, sgs1 top3 getransformeerd met YEp112SpGAL-WRN (E84A, K577M, R834C, en K1016A) werden streaked op SC minus Trp platen die ofwel glu of gal bij de aangegeven concentraties. Voor de controles, werd sgs1 top3 stam getransformeerd met YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN of YEp112Sp GAL-SGS1 inbegrepen. Platen werden vervolgens geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 2 dagen.

2. Liquid Culture analyse:

1. Het evalueren van de groei van getransformeerde sgs1 top3 stammen in vloeibare cultuur, werden gistcellen gegroeid in SC raf min Trp bij 30 ° C gedurende de nacht. Culturen werden reinoculated in SC raf minus Trp en gegroeid bij 30 ° C tot begin log-fase (OD ₆₀₀ van ~ 0.5). Culturen werden vervolgens reinoculated bij OD _0.05 in SC media die 2% gal en de groei werd gevolgd door het meten van absorptie op de aangegeven tijdstippen.

5. Genetische analyse van hydroxyureum of methylmethane-sulfonaat gevoeligheid in WRN getransformeerd giststammen.

1. Voor het bepalen van het effect van de WRN expressie op de MMS en HU gevoeligheid van sgs1 of sgs1 top3 stammen, stammen getransformeerd met YEp112SpGAL of YEp112SpGAL-WRN werden gekweekt in SC raf min Trp bij 30 ° C.
2. Culturen werden reinoculated in SC raf minus Trp en gegroeid bij 30 ° C tot begin log-fase (OD ₆₀₀ van ~ 0,6 tot 0,8).
3. Tienvoudige seriële verdunningen van deze stammen werden bereid met behulp van SC medium zonder Trp. Van een exponentieel groeiende cultuur, waren 5 x 10 ⁶ cellen genomen en serieel verdund tot 10.000-voud. Vier microliter van elke verdunning werd gespot op SC gal minus Trp platen met de aangegeven concentraties van de HU of MMS. Platen werden geïncubeerd bij 30 ° C.
4. Als een controle, wild-type ouderlijke stam (W303-1A) getransformeerd met YEp112SpGAL of YEp112SpGAL-WRN, of sgs1 top3 / YEp112SpGAL-SGS1 werd behandeld als hierboven beschreven.

6. Celcyclus verdeling van de WRN getransformeerd sgs1 top3 stam.

1. De studie van de celcyclus verdeling van de WRN getransformeerd sgs1 top3 stam, culturen van sgs1 top3 getransformeerd met YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN, of YEp112SpGAL-SGS1, en ​​de vector-getransformeerde wild-type ouderlijke stam (W303-1A) werden gekweekt in SC raf trp min bij 30 ° C voor de overnachting.
2. Culturen werden reinoculated bij OD _0.05 en mag groeien til vroege log-fase (OD ₆₀₀ van 0,5 -0,6). WRN expressie werd geïnduceerd door het toevoegen van gal tot 2% eindconcentratie. Culturen werden vervolgens toegestaan ​​om te groeien bij 30 ° C gedurende 6 uur
3. Culturen werden vervolgens verwerkt voor DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) kleuring.
   1. Culturen werden geoogst door centrifugatie bij 5800 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur (RT).
   2. Cellen werden eenmaal gewassen met 1X fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en werden vervolgens gefixeerd in 70% ethanol gedurende 20 minuten bij RT.
   3. Vaste cellen werden tweemaal gewassen met 1 X PBS, en tenslotte geresuspendeerd in 1X PBS.
4. Cellen werden geplaatst op dia en gemonteerd in Vectashield montage medium met DAPI (1 ug / ml) (Vector, USA). Cellen werden onderzocht met een Axiovert 200 M microscoop (Zeiss, 100x lens) en composiet differentieel interferentie contrast (DIC). Fluorescentie-beelden werden geanalyseerd met behulp van AxioVision, versie 3.0-programma (Zeiss).

7. Western blot analyses.

1. Voor het bepalen van de eiwitexpressie van WRN of de WRN varianten in getransformeerde sgs1 of sgs1 top3 stammen, werden lysaten voorbereid door de volgende methode en eiwitten geanalyseerd door immunblotting.

1. Getransformeerd sgs1 of sgs1 top3 stammen werden gegroeid in SC raf min Trp bij 30 ° C voor de overnachting.
2. Kweken werden reinoculated en geïncubeerd bij 30 ° C tot het begin van de log-fase (OD ₆₀₀ van 0,5 - 0,8) en vervolgens geïnduceerd door het toevoegen van gal tot 2% eindconcentratie. Culturen werden vervolgens toegestaan ​​om te groeien bij 30 ° C gedurende 6 uur
3. Cells (3 ml) werden verzameld door middel van centrifugeren en gewassen met PBS. Celpellet werd geresuspendeerd in alkaline lysis buffer [50 mM NaOH, pH 10,5, 2 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercapto-ethanol en proteaseremmers (Roche Molecular Biochemicals)] , gekookt voor 5 min, verduidelijkt door middel van centrifugeren, en geneutraliseerd met 1 M HCl.
4. Eiwitten uit equivalente hoeveelheden cellysaat werden opgelost op 8-16% polyacrylamide SDS-gels.

2. Voor het bepalen van het niveau van expressie van de WRN eiwit onder de invloed van verschillende concentraties van galactose, werden de kweken als volgt verwerkt.

1. Omgevormd sgs1 top3 stammen werden gegroeid in SC raf min Trp bij 30 ° C voor de overnachting.
2. Kweken werden reinoculated en geïncubeerd bij 30 ° C tot het begin van de log-fase (OD ₆₀₀ van 0,5 - 0,8) en vervolgens geïnduceerd door het toevoegen van gal tot 2% eindconcentratie. Culturen werden vervolgens toegestaan ​​om te groeien bij 30 ° C gedurende 6 uur
3. Cellen werden geoogst door centrifugeren en geresuspendeerd in buffer (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1% natriumdeoxycholaat, 1% Triton X-100, 0,1% natriumdodecylsulfaat [SDS]) met proteaseremmers (0,05% PMSF, 0,05 microgram / ml leupeptin).
4. Glazen kralen (425 tot 600 micrometer) werden toegevoegd aan het mengsel, en de cellen werden gebroken door vortexen.
5. De resulterende homogenaat werd gecentrifugeerd gedurende 5 min bij 15.000 xg en het supernatant fractie werd verzameld.
6. Proteïne in het lysaat fracties werd geschat door Bradford methode.
7. Gelijke concentratie van eiwitten van de verschillende fracties lysaat werd opgelost op 8-16% polyacrylamide SDS-gels.

3. Expressie van WRN of WRN mutante eiwitten werd bepaald door Western blot met behulp van een WRN muis monoklonaal antilichaam gericht tegen een epitoop in een gezuiverde C-terminale fragment van WRN [6] (1:1000, Spring Valley Labs).

4. Primair antilichaam incubatie werd gevolgd door incubatie met een secundaire (mierikswortel peroxidase-geconjugeerd) antilichaam (1:5000). Blots werden verwerkt met een ECL Plus West-detectie systeem per protocol van de fabrikant.

5. Voor kwantitatieve Western blot-analyse, toenemende concentraties van gezuiverd recombinant His-tagged full-length WRN proteïne werden opgenomen op gels zoals dat bij de kwantificering van de blot een standaard lineaire curve kan worden gegenereerd. Verder werden cel uittreksel uit equivalente hoeveelheid cellen of 20 ug van het gist lysaat samples geladen op gels om de concentratie van de WRN te schatten.

6. ImageQuant analyse werd vervolgens uitgevoerd op gels en standaard lineaire curve werd gegenereerd.

7. Concentratie van de WRN eiwit op verschillende gal concentraties werd geschat met behulp van standaard lineaire curve boven gegenereerd.

8. Representatieve resultaten

Alle stammen die in deze studie zijn Trp auxotrophs. Daarom, sgs1, sgs1 top3 en wild type W303-1A stammen getransformeerd met YEp112SpGAL of YEp112SpGAL-WRN werden geselecteerd op basis van hun vermogen om te groeien in de aanwezigheid van SC minus Trp media. Om te onderzoeken van het effect van WRN expressie op de groei van getransformeerde sgs1 top3 mutant cellen, werden de kweken strepen op platen met SC minus Trp media met 2% tot gal WRN expressie induceren. Top3 decatenates verweven DNA-moleculen die door Sgs1 helicase tijdens replicatie [1, 2], dus, bij het ontbreken van top3, torsie stress is niet verlicht resulteert in trage groei en hyper-recombinatie. De genetische functie van sgs1 is te onderdrukken de trage groei fenotype van een mutant top3. Als WRN konden voor SGS1 vervanger in genetische interactie met de top3, zou het herstel van top3 trage groei fenotype in sgs1 top3 worden verwacht.

Zoals getoond in Figuur 2A, de WRN getransformeerd sgs1 top3 stam groeide aanzienlijk minder snel in vergelijking met de vector getransformeerd sgs1 top3 stam. Sgs1 top3 getransformeerd met de YEp112SpGAL-SGS1 plasmide werd opgenomen als een positieve controle (Figuur 2A), waaruit blijkt dat wild-type Sgs1 uitgedrukt in de top3 sgs1 mutant in staat was om genetisch aanvulling op de groei van fenotype. De getransformeerde sgs1 top3 stammen groeide eveneens in de afwezigheid van gal zoals aangegeven voor 2 dagen (Figuur 2A). Expressie van WRN had geen effect op de groei van het ouderlijk wild-type (W3031A) of sgs1 stammen (figuur 2B), wat aangeeft dat het effect van de WRN op de celgroei is specifiek voor dat waargenomen in de top3 sgs1 mutant achtergrond. Genetische studies uitgevoerd met behulp van WRN varianten laten zien dat WRN helicase, maar niet exonucleaseactiviteit vereist was voor de restauratie van de top3 groei fenotype (figuur 3B). Een van nature voorkomende missense polymorfisme in de WRN dat interfereert met helicase activiteit afgeschaft zijn vermogen om top3 langzame groei fenotype te herstellen.

top3 gemuteerde stammen zijn vertraagd in de late S/G2 fase van de celcyclus [1], een kenmerk dat kan goed zijn voor hun langzame groei. Mutatie van het SGS1 gen in de top3 achtergrond onderdrukt de vertraging in de S/G2 fase van de celcyclus. Als WRN uitdrukking zou de vertraging in de S/G2 fase van de celcyclus in sgs1 top3 te herstellen, zou een verhoogde populatie van grote hoofdknop cellen met onverdeeld kernen worden verwacht voor sgs1 top3 mutant cellen die WRN. Zoals weergegeven in figuur 4, het percentage van de grote hoofdknop cellen was hoger voor sgs1 top3 / WRN dan sgs1 top3 / vector, wat suggereert dat de restauratie van het S/G2 de leg kenmerk van top3.

De sgs1 top3 dubbele mutant is minder gevoelig voor MMS of HU is dan de top3 een mutant [2]. Sinds WRN aangetast celgroei van sgs1 top3, we volgende onderzocht het effect daarvan op de gevoeligheid voor methylmethane sulfonaat (MMS, een alkylerende stof) en hydroxyurea (HU, een replicatie-remmer). Sgs1 top3 / WRN getoond gevoeligheid voor zowel de geneesmiddelen die vergelijkbaar zijn met sgs1 top3 / SGS1 (figuur 5). Genetische analyse van WRN varianten bleek dat WRN helicase / ATPase, maar niet WRN exonucleaseactiviteit, was die nodig zijn voor het effect ervan op de gevoeligheid voor MMS en HU.

Figuur 1. Schematische voorstelling voor het klonen van WRN / WRN varianten in YEp112SpGAL vector. Alstublieft Klik hier voor een grotere versie van figuur 1.

Figuur 2. WRN uitdrukking in sgs1 top3 herstelt de trage groei fenotype van top3. Panel A, sgs1 top3 stam getransformeerd met YEp112SpGAL of YEp112SpGAL WRN zijn strepen op een SC-Trp plaat bestaande uit 2% glu of 2% gal. Als een controle sgs1 top3 stam getransformeerd met YEp112SpGAL SGS1 werd strepen op zowel de platen. Platen werden geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 2 dagen en dan gefotografeerd. Panel B, Wild type ouderlijke stam W303-1A of sgs1 stam getransformeerd met YEp112SpGAL of YEp112SpGAL WRN zijn strepen op een SC-Trp plaat ofwel met 2% glu of 2% gal . Platen werden geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 4 dagen en dan gefotografeerd. Samenstelling van de platen was als in Panel A en B respectievelijk Panel. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.

Figuur 3. WRN ATPase / helicase, maar niet exonucleaseactiviteit, is nodig om de trage groei fenotype van top3 te herstellen in sgs1 top3 achtergrond. Sgs1 top3 stam getransformeerd met ATPase / helicase-dead (YEp195SpGAL WRN K577M), exonuclease-dood (YEp195SpGAL- WRN E84A), was RQC mutant (YEp195SpGAL-WRN K1016A), of polymorfe mutant (YEp195SpGAL-WRN R834C) strepen op de SC-Trp platen bestaande uit 2% glu (Panel C) of 2% gal (Panel B). Platen werden geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 2 dagen en dan gefotografeerd. Samenstelling van de platen was als in Configuratiescherm A. Neem Klik hier voor een grotere versie van figuur 3 te zien.

Figuur 4. WRN expressie induceert S/G2 arrestatie in sgs1 top3 cellen. Logaritmisch groeiende culturen van sgs1 top3 stam getransformeerd met YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN of YEp112SpGAL SGS1, en ​​de vector-getransformeerde wild-type ouderlijke stam werden geïnduceerd op 2% concentratie van gal voor 6 uur Culturen werden geoogst, verwerkt voor DAPI kleuring, zoals beschreven in Materialen en Methoden en werden waargenomen met behulp van Axiovert 200 M microscoop (Zeiss, 100x lens). Afgebeeld is de DAPI kleuring van de sgs1 top3 getransformeerd met YEp112SpGAL (linksboven) en met YEp112SpGAL WRN (rechtsboven). Pijlen wijzen naar cellen met onverdeeld kernen. Verdeling van de cellen in G1 (enkele cellen) en S/G2 (gebloeid had cellen) is te zien in onderste paneel. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 4 te zien.

Figuur 5. Effect van de WRN expressie op de MMS en HU gevoeligheid van sgs1 top3 stam. Logaritmisch groeiende culturen van sgs1 top3 stam getransformeerd met YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN, exonuclease-dood (YEp112SpGAL-E84A WRN), ATPase / helicase-dead (YEp112SpGAL WRN K577M), RQC mutant (YEp112SpGAL-WRN K1016A), mutant polymorfe (YEp112SpGAL-WRN R834C), YEp112SpGAL SGS1 en vector getransformeerd wild type ouders stammen werden gespot in een tien-voudige seriële verdunningen op SC-Trp platen met glu of gal en ofwel MMS of HU bij de aangegeven concentraties. Platen werden geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 2 dagen (controle platen) en 4 dagen (MMS en HU platen) en vervolgens gefotografeerd. Alstublieft9/1639fig5.jpg "> klik hier om een grotere versie van figuur 5 te zien.

Discussion

Een van de sterke punten van het gebruik van gist als model systeem is de beschikbaarheid van de mutanten in bepaalde DNA-replicatie en reparatie trajecten die zijn geconserveerd tussen gist en mens. Verdere selectie van transformanten herbergen de specifieke genen is makkelijk en betrouwbaar als het laboratorium stammen auxotrofe mutanten en vectoren met auxotrofe markers zijn direct beschikbaar. Met behulp van deze vectoren de expressie van het gen-producten kan worden geregeld door ze onder de controle van een induceerbare promoter (bijv. gal induceerbare promoter, enz.). Gezien deze voordelen, ontwikkelden we een gist gebaseerde model systeem aan de functionele eisen van het menselijke WRN gen defect in Werner Syndroom in een route die mogelijk is geconserveerd tussen mens en gist te bestuderen. Met behulp van de beschreven benaderingen, wij voor het eerste bewijs dat WRN kan functioneren in een genetische route die top3-gerelateerde fenotypes beïnvloedt. Onze waarnemingen snel nader onderzoek van de mogelijkheid dat WRN functioneel met Top3α in menselijke cellen interactie tijdens de cellulaire DNA replicatie of recombinatie. Denkbaar, in een BLM-verminderde conditie kan WRN gedeeltelijk ter vervanging van BLM via haar eiwit partnership met een topoisomerase.