Summary
Микрожидкостных устройств perifusion островок был разработан для оценки динамических секреции инсулина несколько островков и одновременное флуоресценции притока кальция и митохондриальной возможных изменений.
Abstract
Микрожидкостных устройств perifusion островок был разработан для оценки динамических секреции инсулина несколько островков и одновременное флуоресценции притока кальция и митохондриальной возможных изменений. Устройство состоит из трех слоев: первый слой содержит массив микромасштабной скважин (500 мкм и диаметром 150 мкм глубина), которые помогают обездвижить островков в то время как воздействию потока и максимально открытой площади островков, второй слой содержит круговой perifusion камеры (3 мм в глубину, 7 мм в диаметре), а третий слой содержит приточно-смешивание канала, который поклонники до введения в perifusion камеры (2 мм в ширину, 19 мм в длину и 500 мкм в высоту) для оптимизации эффективность перемешивания перед входом perifusion камеры. Создание различных градиентов глюкозы в том числе линейных, форму колокола, и квадратные формы также могут быть созданы в микрожидкостных сети perifusion и продемонстрировал.
Protocol
А. микротехнологий из 3-х слойные устройство perifusion микрожидкостных
Нижняя Ну Мастер протокола (150 мкм глубоких скважин)
- Чистая пластины использованием лезвие в случае необходимости. Очистите ацетон, метанол, и МПА. Выполните плазменной обработки на 50 Вт в течение 30 сек
- Спиновые SU8-100 @ 2000 оборотов в минуту. [Шаг 1: 500 оборотов в минуту, 10 с, 100 об / с, Шаг 2: 2000 оборотов в минуту, 30 с, 300 об / с].
[Примечание: не держите пластины с помощью пинцета после вращения SU8] - Мягкие выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 20 мин, а при 95 ° С в течение 50 мин.
- Пластины под действием УФ света через желаемую маску. Доза для 150 мкм высота составляет 650 мДж / см 2.
- Сообщение экспозиции выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 1 мин, а при 95 ° С в течение 12 мин.
- Разработка пластин в SU8 разработчика в течение 15 мин.
Microchannel Мастер протоколу (500 мкм глубоких скважин)
- Чистая пластины использованием лезвие в случае необходимости. Очистите ацетон, метанол, и МПА. Выполните плазменной обработки на 50 Вт в течение 30 сек
- Спиновые SU8-2150 @ 1000 оборотов в минуту. [Шаг 1: 500 оборотов в минуту, 10 с, 100 об / с, Шаг 2: 1000 оборотов в минуту, 30 с, 300 об / с].
- Мягкие выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 15 мин, а при 95 ° С в течение 2 часов и 30 минут.
- Пластины под действием УФ света через желаемую маску. Экспозиционной дозы на 650 мкм, высота 685 мДж / см 2.
- Сообщение экспозиции выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 5 мин, а при 95 ° С в течение 35 минут.
- Разработка пластин в SU8 разработчика в течение 20-30 мин.
PDMS приготовления раствора
- Полидиметилсилоксан (PDMS) раствор готовят тщательного перемешивания 10 частей силиконового эластомера с 1 частью отвердителя стандартного Sylgard 184 комплекта.
- Пузырьками генерируется в решение PDMS в процессе смешивания происходит с помощью вакуум-эксикаторе.
- Без пузырей решение PDMS медленно обойтись на SU8 мастеров и пустые чашки Петри для третьего слоя.
- Температура горячей пластине установлен до 75 ° С и PDMS лечится при этой температуре в течение 2 часов
- Входы, выходы и обмен скважин штампуют используя соответствующий размер отверстия перфоратором.
- Слои соединены вместе на предметное стекло (размер 0,1 мм) с помощью портативного устройства плазмы.
Б. Экспериментальная установка
- Поток 70% этанола через микро-устройства для стерилизации. Поток DI воды, чтобы смыть этанола. Заливать 50 мл 0,5% BSA через устройство для предотвращения неспецифической адсорбции инсулина микроканальных стен.
- Градиент глюкозы рампы и другие связанные с градиентами порожденных LabView программное обеспечение, которое взаимодействует с шприцевые насосы проходят тестирование, чтобы убедиться, градиенты являются стабильными.
- 25-30 мышей островки инкубировали с 5 мкМ Fura-2/AM (кальций показатель, Молекулярные зонды, CA) и 2,5 мкМ родамина 123 (Rh123, митохондриальная Индикатор потенциалов, Sigma, MO) в течение 30 мин при 37 ° С в Кребс-Рингер буфер (KRB), содержащий 2 мМ глюкозы
- Мышей островков тщательно пипеткой в микрожидкостных устройств perifusion через входное отверстие.
- Микрожидкостных сеть, то установку, подключив входе шприцевые насосы использованием трубки Tygon и Y-разъем и выход на долю коллектора. Устройство сидит на стадии нагрева (37 ° С) на микроскоп и впускной трубы нагревают на плите, чтобы поддерживать температуру в камере и раствора при температуре 37 ° C.
- Сразу же после установки, мышей островки perifused с KRB, содержащий 2 мМ глюкозы в течение 10 мин, а затем глюкозы рампы (2 мм 25 мм) в течение 25 мин.
- Покадровый изображения собраны и проанализированы каждые 15 с программным обеспечением SimplePCI. Perifusate также собираются каждую минуту с использованием фракция коллектор для анализа секреции инсулина использованием ИФА.
Представитель Результаты
Мышь островки были perifused с линейным градиентом 2-25 мМ глюкозы. Как показано на рисунке 1, приток кальция и секрецию инсулина срабатывает примерно через 13 минут perifusion, что соответствует 6 мМ глюкозы. Изменения в митохондриальной потенциалы видели ранее, как ожидается, около 11 минут. Эти данные демонстрирует преимущество использования этой микрожидкостных сети, чтобы охарактеризовать островок физиологии.
Рисунок 1. Физиологические ответы на островковых клеток стимуляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Традиционные островок perifusion систем (макроуровне и микромасштабной) имеют некоторые ограничения в том числе сложные настройки и дизайн, высокие технические требования, а также трудности для создания пользовательских предписано химические градиенты в системе. Микрожидкостных системы perifusion описанные здесь преодолевает эти ограничения с простой геометрией проектирование и изготовление. Что более важно, эта система может быть интегрирована с флуоресценции подход изображений, которые обеспечивают как уникальный инструмент для изучения островок физиологии. Система продемонстрировала с высоким отношением сигнал-шум и пространственно-временным разрешением этих сигналов флуоресценции. Текущий прототип устройства также может содержать несколько установках perifusion в одном чипе и предоставляют различные типы микросреды для широкого целей применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана AAUW международной стипендии Adeola Adewola, NIH / NCRR (U42RR023245) Хосе Оберхольцером, и проект Чикаго диабета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60ml Syringes | BD Biosciences | ||
| Fura-2 fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silicone tubings | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Syringe connectors | Cole-Parmer | female luer plug 1/16” | |
| Straight connectors | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Elbow connector | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Perifusion device | |||
| Hot plate | PMC | ||
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraction collector | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Inverted epiflorescence microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Charge-coupled device | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
References
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
