Summary
מכשיר אוטומטי microfluidic פותחה עבור במחזור העשרה תא גרעיני מן הדם ההיקפיים באמצעות תמוגה כדורית אדומה המבטיח בידוד המדגם באיכות גבוהה ללא אובדן התא.
Abstract
בדו"ח זה פרוטוקול עבור מכשיר אוטומטי תמוגה microfluidic דם מפורט. במחזור התאים בעלי הגרעין (CNCs), כולל לויקוציטים ותאי האנדותל, לספק פלטפורמה אידיאלית עבור מצב עדכנית על מצב המערכת החיסונית של אדם. פרוטוקול microfluidic מאפשרת העשרה של CNCs ללא הפסד תא סלקטיבית הכנת המדגם השתנות עקב המשתמש בתיווך צעדים. בקצרה, הפרוטוקול כולל ייצור המכשיר, אוסף מדגם, הגדרת המכשיר, והפעלה הדם דרך תא microfluidic. בתוך המכשיר הדם כולו מעורבב במהירות של כ 10 שניות בתוך 50 מיקרון ערוץ x 150 microfluidic מיקרון עם מים deionized. בזמן הזה הם אריתרוציטים תוחלת lysed בשל תנאי hypotonic. מבנים אדרה בתחתית הערוץ להבטיח ערבוב יסודי חשיפה של תאים לסביבה קבוע. התאים הנותרים הם חזרו לתנאים איזוטוני ביציאה של המכשיר, שימוש קבוע paraformaldehyde 2%, centrifuged להפריד פסולת כדורית אדומה מן CNCs, ותלויה חיץ זרימה עבור מכתים וניתוח על ידי cytometry הזרימה. תוצאות להראות נקי cytometry זרימה פיזור חלקות עם אוכלוסיות CNC נשמר. המשמעות של המכשיר הזה מגיע פרוטוקול במחקר והבנה של בהיווצרות המחלה על ידי ניתוח של אוכלוסיות CNC. לפיכך, אוטומציה, יעילות, ופשטות של פרוטוקול microfluidic הם הפגינו.
Protocol
חלק 1. המכשיר microfluidic ייצור
עובש אב סיליקון של המכשיר תמוגה microfluidic נוצר באמצעות טכניקות photolithographic סטנדרטי עם הציוד באוניברסיטת לואיוויל cleanroom [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc, בסן רפאל, קליפורניה) שימש ליצור מסיכת שקיפות (Fineline הדמיה, קולורדו ספרינגס, CO) כדי ליצור העתקים שלילית של הערוצים. המכשיר תמוגה microfluidic היה מפוברק בין עובש האב סיליקון תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיות רך עם אלסטומר פולי (dimethylsiloxane) (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). אלסטומר עם ערוצי משוכפל שוחרר, וגישה ערוץ נוקבו חורים עם מחט 20-מד (חלקים קטנים, מיראמר, פלורידה.). רקיק PDMS היה קשור באופן בלתי הפיך לשקופית זכוכית באמצעות פלזמה חמצן ונבדק לניסויים.
חלק 2. פרוטוקול להפעלת המכשיר תמוגה
אחרי המכשיר microfluidic כבר מפוברק ונבדק, ניסויים תמוגה כדורית אדומה מוכן להתחיל. פרטים בסעיף הבא את הפרוטוקול עבור המכשיר microfluidic.
2.1 לדוגמה אוסף
- איסוף 4 מ"ל של דגימת דם מהעורק cubital חציון, על עורק הזרוע הקדמי של המטופל עם קרישה כמו הפרין בשני 2 vaccutainers מ"ל העליון ירוק.
- בטל הצינור הראשון 2 מ"ל מכיוון שהיא מכילה וחילצה לתאי אנדותל בוגרים (חיוביות שגויות).
- Resuspend הצינור השני לערבב הפרין עם דם על ידי סיבוב למעלה ולמטה; להציל מיד על הקרח.
- העברת 1 מ"ל של דם צינור Eppendorf 1.5 מ"ל. תהליך דגימת דם באופן מיידי (תוך שעה אחת לאוסף).
2.2 המכשיר microfluidic ראש עם PBS
- השג מכשיר microfluidic קשור זכוכית. לחץ להתאמה גישה צינורות (חלקים קטנים, מיראמר, פלורידה) בקוטר של מעט יותר את פתחי הכניסה ועל היציאה (איור 1).
- צרף מחט מזרק 30-מד (חלקים קטנים, מיראמר, פלורידה) כדי צינורות על כל פתחי הכניסה, מספקת את ממשק מאקרו ומיקרו.
- ממלאים מזרק 1 מ"ל עם 1X PBS ולוודא להיפטר בועות על ידי מצליף את מחט המזרק. חבר את PBS טעון מזרק 1 מ"ל עד 1 כניסת למכשיר microfluidic. לחצו על מזרק המכיל את PBS 1X בעדינות ביד עד לפתרון זורם מתוך כניסת 2, ומיד תפס כניסת 2 עם קליפ קלסר משרדי רגיל
- להמשיך לדחוף את PBS 1X עד נוזל מגיע לנמל היציאה של המכשיר מיקרופלואידיקה. לאחר פתרון זורם מתוך משקע, מהדק את צינור מוצא עם קליפ אחר קלסר.
- להמשיך לדחוף את המזרק עד 1 מ"ל PBS 1X זורם מתוך כניסת 3, מהדק את יציאת כניסת 3 עם קליפ אחר קלסר משרדי. המכשיר מיקרופלואידיקה כיום ערוכה באופן מלא.
באיור 1. סכמטי של המכשיר מראה פתחי הכניסה פתרונות בהתאמה לשקע.
2.3 הכנת משאבות מזרק פתרון
- כדי לכייל את משאבות בצע את הפעולות הבאות:
- עבור משאבת מזרק גדול הרווארד (Harvard, PhD חלק 22/2000 # 702000): הגדרת תצורת בקוטר 22.5 מ"מ, קצב הזרימה 600 μl / min.
- עבור משאבת מזרק קטן הרווארד (Harvard, פיקו פלוס חלק # 702213): הגדרת תצורת בקוטר 4.61 מ"מ, קצב הזרימה 20 μl / min.
- למלא את אחד מזרק 30 מ"ל מים deionized סטרילית. ניתן להשיג זאת על ידי משיכת הפתרון ישירות מן הצינור חרוטי 50 מ"ל. (לייבל את המזרק)
- מלא את המזרק השני עם 30 מ"ל paraformaldehyde 2X פוספט שנאגרו-מלוחים, (PBS) 2% (PFA) באמצעות ההליך המתואר בשלב 9. (לייבל את המזרק)
- ממלאים מזרק 1 מ"ל עם 1X PBS מן aliquots מאוחסנים 15 צינורות חרוטי מ"ל, באמצעות ההליך המתואר בשלב 9.
- חבר את 30 מ"ל מים deionized המזרק כניסת 2 ו 30 מ"ל 2X מזרק PBS על כניסת 3 (לוודא שאתה לא בועות לא מלכודת בצינור או ההתקן מיקרופלואידיקה). הסר את מהדק מ פתחי הכניסה 2 ו -3 ואת צינורות מוצא. חבר את 1X PBS 1 מ"ל מזרק לתוך מפרצון 1. הימנע מציגה בועות ידי מילוי מחט מזרק עם נוזל, לחבר את המזרק, והוא מצליף את מחט המזרק כדי להיפטר מבועות.
2.4 כדורית אדומה תמוגה
- הגדר את כל המזרקים על משאבות נאות הרווארד כמפורט להלן:
- סט שני מזרקים 30 מ"ל (אחד המכיל סטרילי, דה מיוננים מים והשני עם 2X PBS, PFA 2%) יחד על המשאבה הרווארד מזרק גדול.
- הגדר את מזרק 1 מ"ל (המכיל 1X PBS) על המשאבה הרווארד מזרק קטן.
- מקמו את צינור מוצא ב אספן פסולת (50 מ"ל צינור חרוטי אשר מתויג waste).
- הפעל את המשאבה הרווארד מזרק גדול (עם מזרקים 30 מ"ל) ולתת לו לרוץ במשך דקה אחת. (ודא שאין בועות ואין דליפה במכשיר או בצינור).
- הפעל את המשאבה הרווארד מזרק קטן ולתת לו לרוץ במשך דקה נוספת. (ודא שאין בועות ואין דליפה במכשיר או בצינור). עצור את המשאבות. המכשיר מיקרופלואידיקה עכשיו הוא מוכן לשמש.
- הסר את המזרק 1 מ"ל המכיל 1X PBS מהמשאבה הרווארד מזרק קטן.
- לאחר קבלת דגימת דם, למלא את המזרק עם 1 מ"ל של 0.05 מ"ל סטרילי 1X PBS ללא השמנה כל הבועות. בשלב הבא, למלא את המזרק עם 0.5 מ"ל של דם המתקבל הצינור Eppendorf. (מזרק 1 מ"ל כעת להכיל נפח הסופי של 0.55 מ"ל של דם ושל חיץ 1X PBS). הערה: שמור את המזרק אנכי בעת מילוי כדי למנוע ערבוב של 0.05 מ"ל PBS בדם.
- חבר את מזרק המכיל את הדם אל מפרצון 1 ו - הר את המזרק בזהירות (שלא לדחוף את הדם דרך צינורות לתוך המכשיר) על המשאבה הרווארד מזרק קטן (את המזרק הוא רכוב אנכי לתוך המשאבה).
- הסר את צינור מוצא מהצינור פסולת לשים צינור נקי צנטריפוגה 50 מ"ל במקומו והניח אותה על דלי של קרח.
- הפעל את המשאבה הרווארד גדול מזרק הראשון ולתת לו לרוץ במשך דקה 1. התחל באיסוף מדגם משקע לתוך הצינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
- הפעל את המשאבה הרווארד מזרק קטן.
- לאחר דגימת דם מזרק 1 מ"ל נסעה לחלוטין דרך המכשיר, לעצור שני משאבות. זה אמור לקחת בערך 20 דקות.
- צנטריפוגה מדגם שנאספו במשך 5 דקות ב 350 XG בטמפרטורת החדר עם מהבלם.
- הסר supernatant ידי הצבת קצה פיפטה בצד הנגדי של גלולה לבנה. הסר כמו supernatant כמה פסולת, אפשרי תא אדום במיוחד, מבלי להפריע גלולה לבנה.
- Resuspend המדגם ב 1 מ"ל של חיץ זרימה (1X PBS, 1% BSA [שור אלבומין בסרום], 2% PFA) על ידי pipetting למעלה ולמטה. העברת מדגם צינור 1.5 Eppendorf מ"ל.
- Microcentrifuge המדגם נאספו במשך 5 דקות על XG 4 בטמפרטורת החדר. השתמש דיוק כמו קודם להסיר את supernatant.
- Resuspend המדגם מ"ל 1 של חיץ תזרים ידי vortexing.
2.5 הכנה לניתוח זרימת cytometric
- לניתוח מדגם באמצעות cytometry זרימה, להוסיף 100 μl של מדגם צינור cytometry הזרימה.
- כדי μl 100 המדגם להוסיף נוגדן שצוין (להבטיח ריכוז נכונה).
- אפשר המדגם כדי לדגור במשך 30 דקות ב 40 ג
- שטפו פעמיים עם חיץ תזרים לפני cytometry הזרימה. צעד לשטוף כוללת הוספת 250 μl של חיץ זרימה, vortexing, centrifuging במשך 5 דקות ב 350 XG, והסרת supernatant עם תור של צינור נוזל cytometry הזרימה.
- Resuspend גלולה ב 250 μl של חיץ לזרום. לדוגמה מוכן לניתוח על ידי cytometry הזרימה.
נציג תוצאות
דם שלם הופעל דרך המכשיר תמוגה microfluidic שלאחר עיבוד פרוטוקול, ridding של אריתרוציטים ומעשיר במחזור התאים בעלי הגרעין (CNCs). תוצאות אידיאלי תניב תזרים נקי cytometry פיזור העלילה עם אוכלוסיות נפרדות CNC. הוצג להלן דמויות 2 ו -3 הם העלילה פיזור השוואות של דגימת דם שלם בלי תמוגה כדורית אדומה עם תמוגה כדורית אדומה ידי פרוטוקול microfluidic עם צירים כמו פיזור קדימה (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) אור. ניתן לראות כי פרוטוקול העשרה microfluidic הוא הכרחי כדי להשיג תזרים נקי cytometry העלילה פיזור.
איור 2. Cytometry זרימה פיזור העלילה של כל דגימת דם ללא תמוגה כדורית אדומה עם FSC וגרזנים SSC.
איור 3. Cytometry זרימת העלילה פיזור של מחזורי התאים בעלי הגרעין עם תמוגה כדורית אדומה microfluidic שכותרתו ידי אוכלוסיות עם FSC וגרזנים SSC. אזור 1 (אדום) מייצג לימפוציטים, אזור 2 (ירוק) מייצג מונוציטים, אזור 3 (כחול) מייצג גרנולוציטים, ואזור 4 (סגול) עדיין לא מאופיין.
סילוק פסולת תא אדום על ידי פיפטה בפרוטוקול חשוב גם בעת הצורך. להלן באיור 4 הוא העלילה פיזור מראה עודף של פסולת תא אדום. למרות שלא ערפול העלילה פיזור כמו באיור 2, צריך להסביר את האירועים הוסיף בשל פסולת כדורית אדומה במהלך ניתוח הנתונים.
איור 4. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים פסולת תא אדום, כפי שניתן לראות באשכולאירועים באזור 5 (ציאן).
תאים מכתים עבור סמנים פנוטיפ מסוים נוגדנים יהיה גם להפיק תוצאות אופייני. בנתונים הבאים פנוטיפ נוגדן כתמים עבור 3 אוכלוסיות לויקוציטים שונים: לימפוציטים, מונוציטים, ו גרנולוציטים. איור 5 מתאר אוכלוסיות לימפוציטים זממו עם גרזנים CD3 CD4 ו. גרנולוציטים ומונוציטים ו מוצגים איורים 6-7 עם צירים כמו FSC לעומת CD14 ו CD66b, בהתאמה.
איור 5. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים לימפוציטים עם CD3 CD4 וגרזנים.
איור 6. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים מונוציטים עם FSC ו CD14 צירים.
איור 7. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים גרנולוציטים עם FSC וגרזנים CD66b.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תמוגה אוטומטיות microfluidic פרוטוקול בדם דווחה. בתוך הפרוטוקול הם צעדים קריטיים ראוי לציין. בסעיף P.2.1, חשוב להשליך את הבקבוקון הדם הראשונה שנאספו במדגם מכיל וחילצה לתאי אנדותל בוגרים מתנהג כמו חיוביות שגויות. ודאו גם להפעיל את דגימת דם בתוך שעה של אוסף. תחול המכשיר microfluidic בסעיף P.2.2, חשוב תחילה להיפטר הבועות. בנוסף, יש למנוע החדרת בועות בעת צירוף מזרקים חדשים המחטים לאורך הפרוטוקול. כאשר ממלאים את המזרק 1 מ"ל דם בסעיף P.2.4, יש לזכור תחילה להוסיף 1X PBS ואת הדם, כל זאת תוך שמירה על המזרק אנכי כדי למנוע תערובת של שני הפתרונות. לפני שמתחילים את משאבת מזרק דוחפים את דגימת דם, להבטיח את משאבת מזרק גדול כבר פועל כך שהמערכת במלוא המהירות. אחרי המדגם סיימה פועל באמצעות המכשיר כבר centrifuged, להסיר בזהירות כמה supernatant ככל האפשר, כולל פסולת תא אדום, מבלי להפריע גלולה לבנה. לבסוף, בסעיף P.2.5 לעקוב פרוטוקול של היצרן כדי להבטיח את הריכוז הנכון של נוגדן נוסף מדגם 100 μL.
יישומים של פרוטוקול microfluidic הם עצומים במחקר קליני. חקירת מצב מערכת החיסון של אדם במונחים של CNCs מייצר מידע חשוב על מצב בריאות עשוי לעזור עם אבחנה והבנה של הפתוגנזה במחלה. גישה אוכלוסיות אלה CNC באמצעות איסוף דגימת דם קל יותר ונוח יותר מאשר ניתוחים הביטוי האנושי הכרוך רקמות הגידול. כדי לבחון את התאים בעלי הגרעין במחזור אחד חייב להיות מסוגל להעשיר את אוכלוסיות מרכיבי דם אחרים, כולל אריתרוציטים, הפונקציה העיקרית של המכשיר דיווח. לפיכך, מחקרים כאלה יפיקו תועלת רבה מן הפרוטוקול דם microfluidic תמוגה.
המשמעות של פרוטוקול microfluidic עולה במונחים של יישומים. מכיוון העשרה תא גרעיני נדרשת במחקרים קליניים של דם, פרוטוקול הדורשים התמחות מעט המשתמש בתיווך צעדים מפיק תוצאות ברורה ועקבית חשוב. פרוטוקול microfluidic מבטיחה עקביות באמצעות אוטומציה חשיפה מבוקרת של תאים לסביבות קשות. עם אחידות בין נתונים קליניים במעבדות יהיה להשוות ישירות [2].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי קרן פרס ח 'וולאס קולטר קריירה בתחילת Translational מחקר. הודות טים אנדרוז, להמטולוגיה / Oncology, לעזרה עם אוסף דגימת דם. כמו כן, הודות ד"ר סם ולהאוזן, cytometry Core זרימה, ג'יימס גרהאם בראון Cancer Center, עזרה בניהול תזרים cytometry דגימות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | ||
| 30-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-301PL-25 | |
| Tygon tubing (.010" ID) | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 20-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-201PL-25 | |
| Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000) | Harvard Apparatus | 702000 | |
| Syringe Pump (Harvard Pico Plus) | Harvard Apparatus | 702213 | |
| Flow cytometry tubes | DB Biosciences | 352052 | |
| Antibody stains | DB Biosciences | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | ||
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | ||
| 30 ml tube | Fisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | ||
| 10X PBS | Fisher Scientific |
References
- White, W. Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD. Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).
- Sethu, P. Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis. Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).
