Summary
नवजात electrophysiologic अध्ययन के लिए माउस रीढ़ की हड्डी के अलगाव का एक प्रदर्शन.
Abstract
नवजात माउस रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका circuitries और हरकत आंदोलन के विकास के अध्ययन के लिए एक मॉडल है. हम रीढ़ की हड्डी विच्छेदन और रिकॉर्डिंग स्नान कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव हरकत अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया की तैयारी को प्रदर्शित करता है. एक बार dissected, रीढ़ की हड्डी वेंट्रल तंत्रिका जड़ों एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए संलग्न किया जा काठ की हड्डी के भीतर केंद्रीय पैटर्न पैदा circuitry के electrophysiologic संकेतों को रिकॉर्ड कर सकते हैं.
Protocol
1. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF) 1 तैयार करें. हम पहले aCSF की एक 10X शेयर मैग्नीशियम या कैल्शियम के बिना एक 2L तैयार. Millimolar में सूचीबद्ध अभिकर्मकों. सूचि संख्या / सिग्मा Aldrich देखें.
| 2 लीटर 10X aCSF (मिलीग्राम या सीए के बिना) | |||
| अभिकर्मक | मिमी | g/2L | सूची |
| KCl | 40 | 5.96 | पी - +९३३३ |
| NaCl | 1280 | 149.61 | S-7653 |
| 3 NaHCO | 210 | 35.28 | S-6297 |
| नाह 4 पीओ 2 | 5 | 1.38 | S-9638 |
| ग्लूकोज़ | 300 | 108.12 | डी +९,४३४ |
| 2L के लिए आसुत जल जोड़ें | |||
हम भी 50ml पानी में MgSO 4 और 2 CaCl के 1M समाधान तैयार करेंगे molarity में प्रयोग से प्रयोग करने के लिए समायोजन के लिए अनुमति देने के लिए और विश्वास दिलाता हूं कैल्शियम समाधान में रहता है.
| 1M कैल्शियम और मैग्नीशियम स्टॉक | |||
| अभिकर्मक | एम | g/50mL | सूची |
| 2 CaCl | 1 | 7.35 | सी ५०८० |
| 4 MgSO | 1 | 12.33 | M-5921 |
aCSF समाधान carbogen (95% O2 / 5% सीओ 2) के साथ मार डाला कैल्शियम या कैल्शियम जोड़ने से पहले पीएच वेग जाएगा कम होना चाहिए.
| 1 लीटर aCSF | |
| अभिकर्मक | आयतन |
| 10X aCSF | 100ml |
| 1M 2 CaCl | 1 एमएल 2ml (विदारक) (रिकॉर्डिंग) |
| 1M 4 MgSO | 1 एमएल |
| कैल्शियम जोड़ने से पहले ~ 800 एमएल आसुत जल, carbogen के साथ 2 मिनट के लिए गैस जोड़ें | |
| 1L आसुत जल जोड़ें. | |
पंपों और टयूबिंग और व्यंजन विदारक से पहले और बाद में उपयोग rinsed होना चाहिए.
विच्छेदन
जबकि विदारक, 1mm कैल्शियम aCSF लगातार carbogen के साथ मार डाला जाना चाहिए. aCSF विदारक पकवान एक बोतल से बाजार में बेच देते किया जा सकता है और विदारक पकवान से बोतल पंप या बर्बाद करने के लिए भेजा. हम एक (Sylgard, डॉव Corning) elastomer लेपित विच्छेदन प्रदर्शन डिश का उपयोग करें.
नवजात माउस तेज कैंची और एक चीरा उदर छाती और पेट के माध्यम से कैंची के साथ बनाया के साथ तेजी से decapitated है. जानवर तो eviscerated है. eviscerated माउस aCSF साथ rinsed है. जानवर तो कीट forelimbs के माध्यम से और पूंछ के आधार पर डाला पिन के साथ विदारक पकवान टिकी है.
स्पाइनल कॉलम एक उदर laminectomy प्रदर्शन करके निकाल दिया जाता है. स्पाइनल कॉलम छोटे संदंश के साथ आयोजित किया जाता है और छोटी कैंची की एक ब्लेड तुरंत बोनी स्पाइनल कॉलम पृष्ठीय डाला जाता है. लामिना एक तरफ और फिर दूसरे पर काट रहा है, जबकि धीरे बोनी स्पाइनल कॉलम उठाने. इस स्पाइनल कॉलम की लंबाई के लिए किया जाता है.
रीढ़ की हड्डी रीढ़ की हड्डी के दोनों ओर के साथ काटने के लिए रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका जड़ों तोड़ और रीढ़ की हड्डी के आसपास meninges में कटौती के द्वारा हटा दिया जाता है. हम बाएँ और दाएँ पक्ष पर कटौती, तो हम इसे मुफ्त रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय पक्ष से जुड़ी meninges कटौती. पृथक कॉर्ड तो aCSF इनलेट अच्छा oxygenation विश्वास दिलाता हूं अगर अतिरिक्त पशुओं विच्छेदित कर रहे हैं के पास पकवान टिकी है.
पृथक रीढ़ की हड्डी तो एक रिकॉर्डिंग डिश के लिए एक छोटे चम्मच या रंग का उपयोग कर स्थानांतरित है. यहाँ हम oxygenated 2mm कैल्शियम aCSF के साथ तैयारी perfuse. रीढ़ की हड्डी elastomer लेपित पकवान और जड़ों के पास कोशिकी, पूरे रूट चूषण इलेक्ट्रोड को स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल किया micromanipulators टिकी है. जब इलेक्ट्रोड टिप मुक्त जड़ अंत निकट है, कोमल चूषण चूषण इलेक्ट्रोड में जड़ को आकर्षित करने के लिए लागू किया जाता है. यह प्रक्रिया कई जड़ों को एक साथ रिकॉर्ड करने के लिए दोहराया जा सकता है.
चित्रा 1. कत्ल और अंतड़ी निकालना ए. तेज कैंची के साथ तेजी से माउस सिर काटना. मस्तिष्क स्टेम से अधिक या कम योगदान कटौती के स्तर के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है. बी प्लेस शिरच्छेद द्वारा बनाई गई वक्ष गुहा के उद्घाटन में एक कैंची की ब्लेड. पूंछ के आधार पर उदर छाती और पेट खोलें. विसरा निकालें और aCSF से कुल्ला.
चित्रा 2. स्पाइनल कॉलम ए निकालना और गर्भनाल के लिए उदर बिछाने हड्डियों के माध्यम से रीढ़ की हड्डी में कटौती की सही स्पाइनल कॉलम और रीढ़ की हड्डी के बीच अंतरिक्ष में कैंची की बाईं ब्लेड डालें. फिर स्पाइनल कॉलम और रीढ़ की हड्डी में और कटौती की बाईं के लिए रीढ़ की हड्डी के बीच अंतरिक्ष में कैंची की सही ब्लेड सम्मिलित करें. बी इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब स्पाइनल कॉलम कोमल कर्षण आवेदन. एक कम कोण पर कैंची पकड़े द्वारा रीढ़ की हड्डी पंचर नहीं ख्याल रखना.
चित्रा 3. स्पाइनल कॉर्ड हटाना ए. रीढ़ की हड्डी और और रीढ़ की हड्डी और जड़ों meninges की हड्डी के लिए पार्श्व बिछाने के माध्यम से रीढ़ की हड्डी में कटौती की सही हड्डियों के बीच अंतरिक्ष में कैंची की बाईं ब्लेड डालें. फिर रीढ़ की हड्डी और हड्डियों के बीच अंतरिक्ष में कैंची की रीढ़ की हड्डी की बाईं करने के लिए सही ब्लेड और डालने के रीढ़ की हड्डी और जड़ों meninges की हड्डी के लिए पार्श्व बिछाने के माध्यम से कटौती. बी अंत में, धीरे व्याख्यान चबूतरे वाला कॉर्ड लिफ्ट और meninges laminae करने के लिए पृष्ठीय की हड्डी को जोड़ने में कटौती. फिर एक कम कोण पर कैंची धारण करके ख्याल रखना रीढ़ की हड्डी पंचर नहीं. भी रीढ़ की हड्डी को करीब जड़ें काट नहीं है.
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Discussion
पृथक नवजात रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका तंत्र development1, 2 अध्ययन का एक विनयशील तरीका प्रदान करता है. नवजात कृन्तकों की काठ का रीढ़ की हड्डी के भीतर, केंद्रीय पैटर्न पैदा circuitry के न्यूरोट्रांसमीटर की उपस्थिति में कल्पित हरकत का उत्पादन कर सकते हैं. इस कल्पित हरकत गतिविधि में लयबद्ध बढ़ जाती है, फटने, कि 0,2 करने के लिए 0,5 हर्ट्ज पर उत्पादित कर रहे हैं के होते हैं. इन फटने कॉर्ड और flexor - extensor प्रत्यावर्तन (ipsilateral L2 L5 करने के लिए सापेक्ष) की लंबाई के साथ छोड़ दिया - सही प्रत्यावर्तन उत्पादन का आयोजन कर रहे हैं. चूहों में कई आनुवंशिक म्यूटेशनों 3-5 असामान्य व्यवहार है दिखाया गया है. समझ कैसे रीढ़ की हड्डी के तंत्रिका circuitry के विकास के दौरान बदल दिया है और आनुवंशिक perturbations तंत्रिका circuitry के अध्ययन CNS में कहीं से सूचित करेंगे.
यह उल्लेखनीय है कि वहाँ कई नियमित रूप से उपयोग में मानक aCSF समाधान कर रहे हैं. नीचे आमतौर पर इस्तेमाल किया aCSF तैयारी की एक टेबल है.
तालिका 1: सामान्य aCSF रचनाओं
| प्रयोगशाला | aCSF संरचना में मिमी |
| Pfaff, O'Donovan, Landmesser (3) | 128 NaCl, KCl 4, 1.5 CaCl 2, 1 MgSO 4, 0.5 2 नाह पीओ 4, 21 3 NaHCO, 30 ग्लूकोज. |
| Goulding Keihn, (5) | 111 NaCl, KCl 3.08, 2.52 CaCl 2, 1.25 MgSO 4, 1.18 2 के.एच. पीओ 4, 25 3 NaHCO, 11 ग्लूकोज |
| Brownstone (6) | 127 NaCl, 1.9-3.9 KCl, 1.2 के.एच. 2 पीओ 4, 2.4 CaCl 2, 1.3 MgCl 2, 26 3 NaHCO, 10 ग्लूकोज |
| Ziskind Conhaim विच्छेदन (7) | 113 NaCl, 3 KCl 1 2 CaCl, 6 2 MgCl, 25 NaHCO 3, 1 2 नाह पीओ 4, 11 ग्लूकोज |
| Ziskind - Conhaim कोशिकी (7) | 113 NaCl, 3 KCl, 2 2 CaCl 1, 2 MgCl, 25 3 NaHCO, 1 2 नाह पीओ 4, 11 ग्लूकोज. |
| O'Donovan लड़की, (8,9) | 139 NaCl, 2.9-5 KCl 17, 3 NaHCO, 1 MgCl 2, 3 2 CaCl, 12 ग्लूकोज |
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Disclosures
जानवरों की देखभाल
Acknowledgments
शमूएल एल Pfaff जीन एक्सप्रेशन प्रयोगशालाओं में जैविक अध्ययन के लिए सॉल्क संस्थान में एक प्रोफेसर और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट में एक अन्वेषक है. यह काम क्रिस्टोफर और दाना रीव फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था. जो Belcovson, केंट Schnoeker और सॉल्क संस्थान में मल्टीमीडिया संसाधन में माइक सुलिवान फोटोग्राफी और संपादन के साथ सहायता प्रदान की है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glucose | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| 1L volumetric flask | |||
| 100mL volumetric flask |
References
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
- Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).
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- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
