Summary
Este protocolo describe la producción de KLRG1 tetrámero, que es una poderosa herramienta para el análisis de KLRG1 ligandos.
Abstract
Las células asesinas tipo lectina G1 receptor (KLRG1) es un tipo de receptores transmembrana II glicoproteína inhibitoria que pertenecen al tipo C-lectina como superfamilia. KLRG1 existe como monómero y como un homodímero disulfuro-ligado. Este receptor, bien conservada se encuentra en las células NK más madura y activa recientemente, así como en un subconjunto de células T efectoras / memoria.
Utilizando KLRG1 tetrámero, así como otros métodos, E, N, R y-cadherinas fueron identificados como KLRG1 ligandos. Estos Ca 2 +-dependiente de la célula-célula moléculas de adhesión forma parte de un dominio extracelular que contiene cinco repeticiones cadherina responsables de las interacciones célula-célula, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático que se vincula con el citoesqueleto de actina.
Generación del tetrámero KLRG1 era esencial para la identificación de los KLRG1 ligandos. KLRG1 tetrámero es también una herramienta única para dilucidar la cadherina roles y jugar KLRG1 en la regulación de la respuesta inmune y la integridad del tejido.
Protocol
Preparación de cuerpos de inclusión
- Inocular 4 x 500 ml frascos de TB cada uno contienen 50 mg / ml de carbenicilina y cloranfenicol con un cultivo de una noche de bacterias que expresan la construcción KLRG1 plásmido. Cuando el OD alcanza 0,6 A a 600 nm, inducir con la adición de 0,4 M IPTG e incubar la cultura de un adicional de 4 horas con agitación a 37 º C.
- Resuspender las células recogidas en el pH del buffer de resuspensión = 8.0 (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) de sacarosa, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Nota: pellets se pueden congelar en este momento.
- Piscina no más de 60 ml de resuspensiones bacteriana en un vaso de polipropileno. Si es necesario ajustar a 60 ml con buffer TE pH 8,0 y revuelva la mezcla a una velocidad media.
- Para agitar la mezcla añadir gota a gota: la lisozima (final = 1 mg / ml), MgCl2 (final = 5 mM), 2 mg DNasa I en el 50% de glicerol contenía 75 mM NaCl, Triton-X100 (final = 1%), TDT ( final = 10 mM).
- Sonicar la solución en hielo durante 1,5 minutos y centrifugar los lisados a 5.000 rpm durante 10 min a 4 ° C.
- Se decanta el sobrenadante.
- Añadir 15 ml de tampón de lavado pH = 8.0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
- En el hielo, ultrasonidos solución durante 1,5 minutos hasta que el pellet es completamente resuspendido.
- Centrifugar las muestras a 5.000 rpm durante 10 min a 4 ° C.
- Repita el lavado 5 veces.
- Repita 5b con tampón de lavado sin Triton X-100, se centrifuga y se resuspende en 4 ml de buffer TE.
- Tome la inclusión de peso húmedo cuerpos lodo y almacenar en buffer TE a una concentración de 30 a 100 mg / ml.
Replegamiento de KLRG1
- Hacer una L de buffer de pH = replegado 8,0 (0,4 M arginina-HCl, 0,1 M Tris pH 8-8.3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA libre de tabletas de inhibidor de la proteasa, 5 mM de GSH y GSSG 0,5 mM) y el frío a 4 ° C mientras se agita.
- Preparar los cuerpos de inclusión para la inyección en la mezcla de plegado: Lo ideal es hacer 5 10 inyecciones cada uno con 0,25 M de concentración 0.5 a fin de que la concentración final de la proteína será 2 3 M.
- Derretir el volumen de 50 mg de suspensión de los cuerpos de inclusión en 7 M GnHCl con 10 mM β-mercaptoetanol.
- Mantenga la inclusión cuerpos / GnHCl mezcla a 37 ° C durante 30 - 40 min y agitar cada 5 minutos para asegurar la fusión completa (purines se pondrá de manifiesto cuando se derrita por completo).
- Centrifugar a máxima velocidad durante 30 minutos en microcentrífuga a 4 ° C y la transferencia del sobrenadante a un tubo de centrífuga de 15 ml. No a la transferencia de cualquiera de los pequeños gránulos negruzcos.
- Ajustar el volumen con el tampón de inyección (3 M GnHCl, 10 NaAcetate mM, pH 4.2,10 mM EDTA).
- Inyectar 1 ml de cuerpos de inclusión diluye cada hora. Cuando se inyecta, mezcle a alta velocidad, añadir 1 ml de la inclusión diluido gota a gota cuerpos con 2 segundos entre cada gota. Cuando la inyección se realiza, remover a baja velocidad.
- Continuar durante la noche de agitación a baja velocidad a 4 ° C.
Concentración de reacciones Replegado
- Siguiendo el protocolo de Millipore s, se concentran la L 1 de pre-filtrado (0,22 m filtrada) mediante una reacción de repliegue agitado Amicon celular y la membrana YM10 NMWL 10K ultrafiltración (Millipore) a ~ 10 ml.
- Concentrado a ≤ 2 ml con un Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
La purificación de KLRG1 tetrámero
- Configuración de la AKTAFPLC a 4 ° C de acuerdo con GE manuales de salud.
- Purificar la forma de monómero de KLRG1 por cromatografía de exclusión mediante un Sephacryl S-200 16/60 de alta resolución de la columna (GE Healthcare) en HEPES 20 mM y 150 mM NaCl. (Ver Figura 1).
- Concentrado a 1 ml con Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
- Uso de enzimas BirA acuerdo con el protocolo de avidez s de biotinylate el monómero KLRG1.
- La biotina libre se elimina por cromatografía de exclusión, como en 2.
- KLRG1 molécula es tetramerized mediante la mezcla de monómero KLRG1 con 4 veces el exceso molar estreptavidina conjugada con PE (BD Biosciences).
Resultados representante
Figura 1. Representante de los resultados positivos de la cromatografía de AKTA FPLC de exclusión por tamaño de la KLRG1 replegada. El gráfico muestra la separación de los monómeros (83,52 ml), dímero (56,36 ml), y multímero (36,26 ml) de la forma replegada KLRG1. El pico a 94,25 ml representa el intercambio de amortiguamiento.
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Discussion
En este protocolo, se muestra cómo purificar, biotinylate y KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetrámero puede ser utilizada para etiquetar KLRG1 ligandos por citometría de flujo. Aunque las condiciones de replegamiento tendrá que ser probado empíricamente para cada proteína, otras de tipo C-lectinas podrían ser tetramerized utilizando un protocolo similar. El uso de proteínas tetramerized como sondas, los ligandos para los receptores de lectina tipo huérfano C-podrían ser identificados.
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Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Naidenko para ayudar en la optimización de las condiciones de replegamiento. Este trabajo fue apoyado por el NIH beca de investigación AI58181 a Laurent Brossay. Cindy Banh es apoyado por el NIH AI080230 NRSA F31.
Stephanie Terrizzi y Banh Cindy contribuyen igualmente a este trabajo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
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