Summary
Dit protocol beschrijft de productie van KLRG1 tetrameer, dat is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van KLRG1 liganden.
Abstract
Killer cell lectine-like receptor G1 (KLRG1) is een type II transmembraan glycoproteïne remmende receptor die behoren tot de C-type lectine-achtige superfamilie. KLRG1 bestaat zowel als een monomeer en als een disulfide-linked homodimeer. Deze goed bewaard gebleven receptor is te vinden op het meest volwassen en recent geactiveerde NK-cellen als op een subset van effector / geheugen T-cellen.
Met behulp van KLRG1 tetrameer evenals andere methoden, E-, N-en R-cadherines werden geïdentificeerd als KLRG1 liganden. Deze Ca 2 +-afhankelijke cel-cel adhesie moleculen bestaat uit een extracellulair domein met vijf cadherine herhalingen verantwoordelijk zijn voor cel-cel interacties, een transmembraan domein en een cytoplasmatisch domein dat gekoppeld is aan het actine cytoskelet.
Generatie van de KLRG1 tetrameer was essentieel voor de identificatie van de KLRG1 liganden. KLRG1 tetrameer is ook een uniek hulpmiddel om de rollen cadherine en KLRG1 spelen toe te lichten bij het reguleren van de immuunrespons en weefsel integriteit.
Protocol
Voorbereiding van de insluitingslichamen
- Inoculeren 4 x 500 ml flesjes van TB elk met 50 ug / ml carbenicilline en chlooramfenicol met een overnachting cultuur van bacteriën de uiting van de KLRG1 plasmide bouwen. Wanneer de OD 0.6 Å bereikt bij 600 nm, braken met de toevoeging van 0,4 M IPTG en de cultuur voor een extra 4 uur schudden geïncubeerd bij 37 ° C.
- Resuspendeer de geoogste cellen in resuspensie buffer pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) sucrose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Let op: pellets kunnen worden ingevroren in dit stadium.
- Zwembad niet meer dan 60 ml van bacteriële resuspensions in een polypropyleen beker. Indien nodig aan te passen tot 60 ml met TE-buffer pH 8,0 en roer mengsel op halve snelheid.
- Om roerend mengsel toe te voegen druppelsgewijs: lysozym (laatste = 1 mg / ml), MgCl2 (laatste = 5 mm), 2 mg DNAse I in 50% glycerol bevatte 75 mM NaCl, Triton-X100 (finale = 1%), DTT ( laatste = 10 mm).
- Ultrasone trillingen de oplossing op ijs gedurende 1,5 minuten en centrifugeer de lysaten bij 5.000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Schenk de bovenstaande vloeistof.
- Voeg 15 ml wasbuffer pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
- Op het ijs, ultrasone trillingen oplossing voor 1,5 min, totdat het pellet volledig geresuspendeerd.
- Centrifugeer de monsters bij 5.000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Herhaal de wasbeurt 5 keer.
- Herhaal 5b met wasbuffer zonder Triton X-100, centrifuge en resuspendeer in 4 ml TE-buffer.
- Neem het natte gewicht insluitingslichamen drijfmest en op te slaan in de TE-buffer bij een concentratie van 30 tot 100 mg / ml.
Hervouwing van KLRG1
- Maak een L van hervouwingsbuffer pH = 8,0 (0,4 M Arginine-HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA-vrije protease-remmer tabletten, 5 mM GSH en 0,5 mM GSSG) en chill tot 4 ° C onder roeren.
- Bereid de insluitingslichamen voor injectie in de vouwen mengsel: Het is ideaal om 5 10 injecties te maken met elk 0,25 0,5 uM concentratie, zodat de uiteindelijke concentratie van het eiwit wordt 2 3 uM.
- Smelt het volume van de 50 mg insluitingslichamen slurry in 7 M GnHCl met 10 mM β-mercapto-ethanol.
- Houd de insluitingslichamen / GnHCl mengsel bij 37 ° C gedurende 30 - 40 min en vortex om de 5 minuten in beslag smelten zorgen (gier zal duidelijk worden wanneer ze volledig gesmolten is).
- Centrifugeer bij max. snelheid gedurende 30 minuten in microcentrifuge bij 4 ° C en breng het supernatant om een 15 ml centrifugebuis. Niet een van de kleine zwartachtige pellet transfer.
- Het volume aanpassen met injectie buffer (3 M GnHCl, 10 mM NaAcetate, pH 4.2,10 mM EDTA).
- Injecteer 1 ml verdund insluitingslichamen elk uur. Bij het injecteren, roeren op hoge snelheid, voeg 1 ml verdund insluitingslichamen druppelsgewijs met 2 seconden tussen elke druppel. Als injectie wordt gedaan, roer op lage snelheid.
- 'S nachts blijven roeren op lage snelheid bij 4 ° C.
Concentratie van hervouwing Reacties
- Volgende protocol Millipore s, concentreren de 1 L van pre-gefilterd (0,22 um gefilterd) hervouwingsreactie met behulp van een Amicon geroerde cel en YM10 NMWL 10K ultrafiltratie membraan (Millipore) tot ~ 10 ml.
- Concentreer tot ≤ 2 ml met behulp van een Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
Zuivering van KLRG1 tetrameer
- Het instellen van de AKTAFPLC bij 4 ° C volgens GE Healthcare handleidingen.
- Zuiveren het monomeer vorm van KLRG1 door grootte uitsluiting chromatografie met behulp van een Sephacryl S-200 16 / 60 met een hoge resolutie kolom (GE Healthcare) in 20 mM HEPES en 150 mM NaCl. (Zie figuur 1).
- Concentraat tot 1 ml met behulp van Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
- Gebruik BirA enzym volgens aviditeit s protocol bij de KLRG1 monomeer biotinylate.
- De vrije biotine wordt uitgescheiden via de size exclusion chromatografie als in 2.
- KLRG1 molecuul is tetramerized door het mengen van KLRG1 monomeer met 4-voudige molaire overmaat PE-geconjugeerd streptavidine (BD Biosciences).
Representatieve resultaten
Figuur 1. Representatieve positieve resultaten van de AKTA FPLC size exclusion chromatografie van de hervouwen KLRG1. De grafiek toont de scheiding van het monomeer (83,52 ml), dimeer (56,36 ml), en multimeer (36,26 ml) vorm van de hervouwen KLRG1. De piek bij 94,25 ml staat voor de buffer uit te wisselen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol wordt aangetoond hoe te zuiveren, biotinylate, en tetramerize KLRG1. KLRG1 tetrameer kan worden gebruikt om KLRG1 liganden label door flowcytometrie. Hoewel hervouwing voorwaarden moeten empirisch worden getest op elk eiwit, kunnen andere C-type lectines worden tetramerized met behulp van een soortgelijk protocol. Met behulp van tetramerized eiwitten als probes, liganden van verweesde C-type lectine receptoren zou kunnen worden geïdentificeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken dr. Naidenko voor hulp bij het optimaliseren van de hervouwing voorwaarden. Dit werk werd ondersteund door NIH onderzoek te verlenen AI58181 aan Laurent Brossay. Cindy Banh wordt ondersteund door NIH NRSA F31 AI080230.
Stephanie Terrizzi en Cindy Banh een gelijkwaardige bijdrage aan dit werk.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.
