Summary
这个协议描述KLRG1四聚体的生产，这是一个强大的工具KLRG1配体的分析。
Abstract
杀伤细胞凝集素样受体G1（KLRG1）是II型跨膜糖蛋白抑制性受体，属于C型凝集素样超家族。 KLRG1存在单体和二硫键相连的二聚体。这种保守的受体上最成熟，最近激活NK细胞，以及效应/记忆性T细胞的一个子集。
使用KLRG1四聚体，以及其他的方法，E，N，和R -钙粘素被确定为KLRG1配体。这些CA 2 +依赖的细胞，细胞粘附分子由胞外域包含五个cadherin的细胞间的相互作用，跨膜结构域和细胞质域与肌动蛋白细胞骨架的重复。
KLRG1四聚体的生成，是必不可少的KLRG1配体的识别。 KLRG1四聚体，也是一个独特的工具，以澄清在调节免疫反应和组织的完整性的作用cadherin和KLRG1发挥。
Protocol
包涵体的制备
- 接种4 × 500毫升烧瓶结核病每个过夜培养的细菌，表达KLRG1质粒构建含有50微克/ ml的羧苄青霉素和氯霉素。当外径达到0.6 A，在600 nm与0.4 M IPTG诱导，并在37孵育一个附加的4小时晃动文化° C。
- 中提取的干细胞重悬在再悬浮缓冲液的pH值= 8.0（50 25％（W / V）蔗糖，1 mM的EDTA，MM的Tris - HCl，10 mM的数码地面电视）。注：颗粒可以在这个阶段被冻结。
- 池不超过60毫升细菌resuspensions的聚丙烯烧杯。如果有必要调整到60毫升，用TE缓冲液pH值8.0，并在半速搅拌混合。
- 以搅拌混合添加下降明智的：溶菌酶（终= 1毫克/毫升），氯化镁（终= 5毫米），2毫克DNA酶我包含在50％的甘油75毫米氯化钠，TRITON - X100（最终= 1％），数码地面电视（最终= 10毫米）。
- 超声冰1.5分的解决方案，并在10分钟5000转离心裂解液在4 ° C。
- 倾倒上清液。
- 添加15毫升的洗涤缓冲液的pH值= 8.0（50毫米的Tris - HCl，0.5％Triton X - 100的的氯化钠，100毫米，1毫米EDTA，1 mM的数码地面电视）。
- 在冰上，超声1.5分钟的解决方案，直到沉淀完全重悬。
- 10分钟5000转离心样品在4 ° C。
- 重复洗5次。
- 洗没有TRITON X - 100，离心机和4毫升TE缓冲液中的悬浮缓冲液重复5B。
- 以湿重包涵体浆在30至100毫克/毫升的浓度，并存储在TE缓冲液。
复性KLRG1
- 1 L复性缓冲液pH = 8.0（0.4 M精氨酸盐酸的0.1 M Tris pH值8-8.3，2毫米EDTA，0.2毫米PMSF，EDTA - 免费蛋白酶抑制剂药片，5毫米GSH和0.5毫米的GSSG）和寒意到4 ° C，边搅拌。
- 准备注入折叠混合物包涵体：这是非常理想，使每5 10注射用0.25 0.5微米的浓度，使终浓度的蛋白质将于2 3微米。
- 融化10毫米的β-巯基乙醇50毫克包涵体浆量在7米GnHCl。
- 保持包涵体/ GnHCl混合物在37 ° C为30 - 40分钟和涡每5分钟，以确保完全融化（完全融化时，泥浆就会清楚）。
- 离心机最大速度离心30分钟在4 ° C，将上清转移至15 mL离心管。做不转让任何黑色的小颗粒。
- 注射缓冲液（3米GnHCl，10毫米NaAcetate mM的EDTA，pH值4.2,10），调整音量。
- 注入1毫升稀释后的包涵体每隔一小时。注射时，在高速搅拌，添加1毫升稀释包涵体下降，下降2秒之间每下降。当注射完成后，在低速搅拌。
- 隔夜继续低速搅拌，在4 ° C。
浓度的复性反应
- Millipore公司S协议，集中1升的预过滤（0.22μm的过滤），复性反应使用Amicon搅拌细胞和YM10 NMWL 10K超滤膜（Millipore公司）〜10毫升。
- 集中≤2毫升，使用一个Centriplus YM - 10 10K截留分子量（Millipore公司）。
KLRG1四聚体的纯化
- 安装在4 ° C，符合GE医疗手册的AKTAFPLC。
- 使用Sephacryl S - 200 16/60高分辨率柱（通用电气医疗集团）在20毫米的HEPES和150 mM氯化钠尺寸排阻色谱纯化单体形式存在的KLRG1。 （见图1）。
- 浓缩至1 ml，使用Centriplus YM - 10 10K截留分子量（Millipore公司）。
- 根据以亲和力S协议，使用比拉酶biotinylate KLRG1单体。
- 免费素是体积排阻色谱2淘汰。
- KLRG1分子tetramerized KLRG1单体与4倍超额摩尔聚乙烯共轭链霉亲和素（BD Biosciences公司）混合。
代表性的成果
AKTA FPLC尺寸排阻色谱图1。代表从积极的成果复性KLRG1。图表显示分离（83.52毫升）的单体，二聚体（56.36毫升），和multimer（36.26毫升）的复性KLRG1形式。 94.25毫升峰代表缓冲区交换。
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Discussion
在这个协议中，它是如何净化，biotinylate，tetramerize KLRG1。 KLRG1四聚体可以用来标记流式细胞仪KLRG1配体。虽然复性条件进行测试，每个蛋白质的经验，其他的C型凝集素可tetramerized使用了类似的协议。使用tetramerized蛋白作为探针，对孤儿的C型凝集素受体的配体可能被确定。
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Acknowledgments
我们感谢博士Naidenko优化复性条件的帮助。这项工作是支持由美国国立卫生研究院的研究经费AI58181洛朗Brossay。辛迪迪班是由美国国立卫生研究院NRSA F31 AI080230支持。
斯蒂芬妮Terrizzi和辛迪迪班平等作出贡献，对这项工作。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
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